雞蛋污染致病菌的分離鑒定及其LAMP技術快檢方法的研究.pdf

1、食品安全已經(jīng)成為全世界關注的焦點問題,食源性致病菌造成的食品污染是產(chǎn)生食品安全問題的主要原因。常見的食源性致病菌主要有出血性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃葡萄球菌、霍亂弧菌和蠟樣芽孢桿菌等。雞蛋是公認的營養(yǎng)食品,我國的人均消耗量逐年提升。但近些年,雞蛋卻經(jīng)常出現(xiàn)安全問題,特別是致病菌微生物的污染給人民的身體健康和國民經(jīng)濟造成重大損失,因而成了國內(nèi)外消費者關注的焦點。環(huán)介導等溫擴增(LAMP,loop-mediated isothermal a

2、mplification)技術運用一套2對可以識別目的基因序列的6個特定區(qū)域引物,在恒定溫度條件下(60-80℃)進行基因擴增。其操作具有設備簡單、快速、特異性高等優(yōu)點,是一種快速檢測食品致病菌的核酸擴增技術,具有較高的應用價值。
　　本論文從市售鮮雞蛋表面分離純化了4株細菌,通過形態(tài)、生理生化及16SrRNA基因片段測序分析,鑒定均為食源性常見致病菌:金黃色葡萄菌Staphylococcus aureus和蠟樣芽孢桿菌Bacil

3、lus cereus。由此可見,金黃色葡萄菌和蠟樣芽孢桿菌是市售雞蛋常見污染致病菌之一。
　　5組不同引物根據(jù)金黃色葡萄球菌特異性的耐熱核酸酶 nuc基因進行設計,其中1組引物被篩選出作為實驗的特異性引物。通過特異性和靈敏性實驗驗證,表明該引物可以用于金黃色葡萄球菌的LAMP檢測。
　　影響LAMP法擴增的主要因素除了引物外,還有底物、Bst DNA聚合酶、擴增溫度、擴增時間等。本文通過這些因素的單因素實驗,最佳的反應體系及

4、條件為:引物各0.5μl, B s t D N A聚合酶1μl(8U),d N T P s1μl,Betaine5μl(1.2M),反應溫度64℃,反應時間60min,總體積25μl。
　　本論文中金黃色葡萄球菌的最低檢測濃度使用LAMP方法檢測,最低濃度為102 cfu/ml,而濃度梯度為101cfu/ml、100 cfu/ml均未見LMAP擴增,參考PCR檢測靈敏度的相關文獻, PCR技術檢測細菌的靈敏度一般也104cfu/m