莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針的設(shè)計及其檢測致病菌的研究.pdf

1、繼Tyagi和Kramer于1996年提出分子信標(biāo)學(xué)說之后，Bockisch等基于分子信標(biāo)檢測的原理提出了一種新穎、廉價的酶聯(lián)構(gòu)象轉(zhuǎn)換分析系統(tǒng)并在細菌核酸檢測中得到了應(yīng)用，即利用親和標(biāo)記了的莖環(huán)結(jié)構(gòu)寡聚核苷酸探針來檢測靶核酸。但是這種方法與分子信標(biāo)一樣在對于存在一個核苷酸誤配的時候能檢測出信號出現(xiàn)假陽性。因此我們利用序列比對的方法在目的病原菌16s rRNA高度保守的區(qū)域?qū)ふ乙欢涡蛄胁⒃O(shè)計為莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針的環(huán)序列，這段序列與其它的高度同源

2、菌種的16s rRNA基因序列片段差異兩個核苷酸以上，從而避免探針環(huán)序列與其他非目的病原菌核酸雜交時出現(xiàn)誤配一個核苷酸的情況，克服出現(xiàn)假陽性的問題。設(shè)計的探針一端固定在96孔酶標(biāo)板上，另一端標(biāo)記上親合大分子。當(dāng)沒有靶核酸的時候，親合分子緊密地靠近在固相支持物的表面，由于探針的閉合構(gòu)象使得酶連接的報告分子不能與親合分子結(jié)合產(chǎn)生信號；當(dāng)存在靶核酸的時候，探針的環(huán)序列與靶核酸完全互補配對使得環(huán)被打開，構(gòu)象發(fā)生變化呈現(xiàn)線性結(jié)構(gòu)，暴露在外的親合分

3、子與報告分子結(jié)合產(chǎn)生信號。這種結(jié)合了序列比對的新探針技術(shù)其靈敏度比其他常規(guī)核酸檢測技術(shù)至少高出一個數(shù)量級。本論文的研究內(nèi)容包括以下兩個方面： 一、基于金黃色葡萄球菌16S rRNA 基因序列，采用序列比對設(shè)計了一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸探針，根據(jù)分子信標(biāo)技術(shù)和酶聯(lián)免疫分析的原理，評估一個實驗方法，即利用能構(gòu)象轉(zhuǎn)換的、固定化的莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針酶聯(lián)檢測靶核酸。因為探針的環(huán)序列即為金葡球菌 16SrRNA 基因序列的其中一個片段，同其他菌種

4、的16S rRNA基因序列誤配2個以上的核苷酸，有效的排除假陽性即不會出現(xiàn)誤配一個核苷酸的情況。 二、為了驗證新實驗方法能應(yīng)用在所有的靶細菌核酸檢測中，選取革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌為研究對象，應(yīng)用此方法成功的分別檢測出金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。 本論文實驗表明，在知道靶細菌基因序列前提下，通過生物信息學(xué)方法設(shè)計的專一性探針和酶聯(lián)構(gòu)象轉(zhuǎn)換分析系統(tǒng)能代替?zhèn)鹘y(tǒng)檢測技術(shù)，甚至能檢測含有變異的靶細菌和應(yīng)用到單核