常見腸道致病菌感染快速診斷芯片的研制與應用.pdf

1、細菌感染是臨床的重要問題，1995年全世界世界死亡5200萬人，至少1200萬死于傳染病，占死亡人數(shù)的32.7％，其中就包括細菌性傳染病。目前培養(yǎng)法是細菌感染診斷的金標準，但費時長(4-7天)，而且不同的細菌培養(yǎng)條件也不相同，也不易同時鑒定多種細菌。國內(nèi)外開展了利用分子生物學及免疫學方法對致病菌進行檢測的研究，包括定性分析的PCR技術(shù)、ELISA及免疫磁珠等，但是這些方法都只是特異的對單種細菌來進行鑒定。而DNA芯片技術(shù)，作為一種大規(guī)模

2、集成的固相雜交技術(shù)，具有高通量的特點，而且所需鑒定時間短(2天)，可能成為細菌感染檢測的重要方法。因此本研究擬采用不對稱PCR，熒光顯色等技術(shù)建立一種檢測常見腸道細菌感染的芯片系統(tǒng)，來對引起腹瀉的常見的致病菌做一個初步的篩查，初步確定到屬，然后再選擇進行特異性的鑒定(如熒光定量PCR)。這樣不僅能夠特異的檢測靶細菌感染，而且可以大大的節(jié)省臨床培養(yǎng)所耗費的時間，有可能在臨床得到廣泛應用。 研究目的：建立一種快速準確的方法對引起腹瀉

3、的常見腸道致病菌做初步的篩查，并對早期的治療和最后的診斷起指導作用。 材料和方法： 1.根據(jù)表一和表二中的引起腸道感染的常見致病菌的相關(guān)流行病學資料，確定將臨床14屬細菌作為研究對象。 2.收集GeneBank中臨床常見的14屬細菌的16SrDNA的60條序列，利用計算機中DNAStar軟件對些序列進行比對，Primer5.0軟件在保守區(qū)中設(shè)計通用引物，在可變區(qū)中設(shè)計特異性探針。 3.培養(yǎng)腸致病性大腸桿菌

4、、蠟狀芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，單核增生型李斯特菌、嗜水氣單胞菌、志賀菌、傷寒沙門菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、空腸彎曲菌、副溶血弧菌、艱難梭菌、普通變形桿菌等常見菌的標準菌株。抽取各菌種的DNA后于-20℃下保存。 4.將cy5標記后的引物以不對稱PCR方法擴增上述提取的細菌DNA后，與固定在芯片上的探針進行雜交，然后在熒光掃描儀中進行掃描，根據(jù)雜交后產(chǎn)生的熒光信號值強弱來判定細菌的種類。 5.收集住院和門診腹

5、瀉病人的糞便200例及正常人糞便50例。 6.提取250例糞便的DNA，并應用此引物和探針進行檢測。以傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)作為金標準，來評價DNAmicroarray方法的敏感度，特異度，假陰性率以及假陽性率。 結(jié)果： 1.在對細菌標準株的檢測中，我們建立的針對16SrRNA序列的基因芯片檢測系統(tǒng)，能夠成功的將14屬的細菌鑒定到屬。在純培養(yǎng)物的最低檢測濃度為103CFU/ml。在模擬糞便標本中的最低檢測濃度為104CF

6、U/ml。 2.在200例腹瀉糞便中，DNAmicroarray檢出93例陽性樣本，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢出89例。其中培養(yǎng)方法陽性，芯片結(jié)果陰性5例；培養(yǎng)方法陰性，芯片結(jié)果陽性9例。以傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法作為檢驗的金標準，基因芯片的敏感度為94.4％，特異度為91.8％，假陽性率為5.6％，假陰性率為10％。 3.在對檢測出的空腸彎曲菌(4例)和小腸結(jié)腸炎耶爾森(6例)菌同時進行real-timePCR檢測，其結(jié)果與芯片結(jié)果吻合

7、度為100％。 結(jié)論： 1.引物和探針對常見的腸道致病菌有較強的特異性。在純培養(yǎng)物的最低檢測濃度為103CFU/ml。在模擬糞便標本中的最低檢測濃度為104CFU/ml。 2.在對臨床200例糞便標本的檢測中，以同時進行的糞便培養(yǎng)作為評價的金標準，基因芯片的敏感度為94.4％，特異度為91.8％，假陽性率為5.6％，假陰性率為10％，表明引物和探針的最低檢測濃度能夠應用于臨床檢測中。 3.DNAmicro