兩種重要甘薯病毒快速檢測技術研究.pdf

1、甘薯卷葉病毒(Sweet potato leaf curl virus，SPLCV)和甘薯褪綠矮化病毒(Sweet potatochlorotic stunt virus，SPCSV)是侵染我國甘薯的兩種主要病毒，近年來在我國主要甘薯產區(qū)嚴重發(fā)生，給甘薯生產造成嚴重危害。建立快速、高效、實用的的病毒檢測技術，加強對甘薯重要病毒的監(jiān)測和預警，對于甘薯病毒病害的防控具有重要意義。
　　本研究建立了PCR法制備地高辛標記探針檢測甘薯卷葉

2、病毒的核酸雜交法。利用非放射性標記物地高辛(DIG)，通過PCR方法制備了甘薯卷葉病毒(SPLCV) CP基因的探針。通過對探針特異性、靈敏性、重復性和穩(wěn)定性試驗，建立了SPLCV斑點雜交檢測方法。結果表明，該探針不與其它常見甘薯病毒發(fā)生反應，具有較強的特異性，最低可檢測到0.9 ng/μl的病毒樣品，具有較高的靈敏性，可用于甘薯田間樣品SPLCV的檢測。
　　甘薯褪綠矮化病毒(SPCSV)可劃分為東非(SPCSV-EA)和西非(

3、SPCSV-WA)兩個株系，近年的檢測結果表明，我國甘薯上主要是SPCSV-WA。本研究根據(jù)GenBank中登錄的SPCSV-WA CP基因序列，本研究利用逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術(reverse transcriptionloop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)，設計4條引物，以感染SPCSV-WA甘薯葉片總RNA為模板，進行一步法RT-LAMP，在65℃條件下反應1h。擴增產物利

4、用瓊脂糖電泳分析和SYBR greenⅠ熒光染料顯色判斷結果，同時對擴增產物的電泳條帶進行基因克隆和測序鑒定。利用常規(guī)RT-PCR和建立的RT-LAMP方法對14份甘薯樣品進行SPCSV-WA檢測，比較兩種方法的檢測結果。建立的LAMP方法可特異地對SPCSV-WA進行檢測，且最低可檢測出101數(shù)量級的模板。RT-LAMP產物的克隆測序表明，感染SPCSV-WA甘薯樣品的RT-LAMP產物為SPCSV-WA CP基因序列。14份田間甘薯