環(huán)介導恒溫擴增法快速檢測艱難梭菌毒素基因.pdf

1、艱難梭菌（Clostridium difficile，C.difficile）是革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌，本身無侵襲性。當機體腸道內環(huán)境受到破壞時，部分產毒性艱難梭菌通過分泌毒素A、B以及二元毒素引起抗生素相關性腹瀉、結腸炎甚至偽膜性腸炎，統(tǒng)稱為艱難梭菌感染(C.difficile infection，CDI)。據報道，隨著艱難梭菌高毒力菌株(BI/NAP1/027型)的出現(xiàn)，艱難梭菌感染的發(fā)病率和死亡率均顯著升高，引起全球的關注。

2、>　　艱難梭菌可分為產毒株和不產毒株，不產毒株不引起臨床癥狀。艱難梭菌產毒株主要分泌毒素A和毒素B，分別由tcdA和tcdB編碼。毒素A又稱腸毒素，容易使腸壁中性粒細胞浸潤，釋放淋巴因子，引起機體液體大量分泌和出血性壞死;毒素B又稱細胞毒素，能使肌動蛋白解聚，損壞細胞骨架，導致細胞固縮壞死，直接損傷腸壁細胞。毒素B的毒力較毒素A強10倍。
　　在歐洲和北美洲引起廣泛暴發(fā)流行的艱難梭菌高毒力菌株(BI/NAP1/027型)除分泌毒素

3、A和毒素B外，還分泌毒力更強的二元毒素(C.difficilebinary toxin，CDT)。CDT由致病性決定區(qū)外的2個染色體基因cdtA和cdtB編碼。cdtA是一種ADP核糖轉移酶，通過阻斷肌動蛋白片段的合成，誘導機體細胞死亡。cdtB是一種運輸蛋白，被絲氨酸蛋白酶激活后，cdtB通過與宿主細胞結合，把cdtA轉移至細胞液中，誘導細胞骨架解聚，生成微管突出物，增強艱難梭菌的定植。
　　環(huán)介導恒溫擴增技術（Loop-med

4、iated isothermal amplification，LAMP），即針對靶基因6-8個特定區(qū)域設計4-6條特異引物，恒溫(63-67℃)時，鏈置換DNA合成在BstDNA聚合酶的作用下，通過自我循環(huán)合成大量目的DNA并產生白色沉淀，從而實現(xiàn)對目的基因的快速檢測。該方法檢測時間短(30-60min)，無需特殊儀器，操作簡便，配合相應顯色試劑還能實現(xiàn)肉眼判別結果。目前，LAMP方法已成功應用于細菌、病毒及寄生蟲的定性和定量檢測、胎兒

5、性別鑒定等，已成為臨床常用的快速檢驗方法。
　　目的：
　　本研究旨在建立一種在恒溫條件下，快速、靈敏、特異、可視化、同步檢測艱難梭菌A、B毒素基因或同步檢測艱難梭菌二元毒素基因的方法，適用于基層醫(yī)療衛(wèi)生單位及各疾病預防控制中心篩查和檢測艱難梭菌及其高毒力菌株，為艱難梭菌的檢測及毒素分型提供新的技術平臺，有利于控制艱難梭菌感染的流行，指導臨床診療。
　　方法：
　　研究對象:2013年8月1日-2014年1月31

6、日期間，收集156例在南方醫(yī)院住院及門診腹瀉患者的新鮮糞便標本（布里斯托分類5-7級），并檢測標本艱難梭菌A、B毒素基因及二元毒素基因的攜帶情況。排除33例糞便標本（23例重復標本、10例糞便量太少或不滿足新鮮糞便標本要求），剩余123例為適合本研究的糞便標本。
　　研究方法及內容:1）.環(huán)介導恒溫擴增法快速檢測艱難梭菌AB毒素基因。①引物的設計:通過BLAST軟件分別針對艱難梭菌tcdA與tcdB重復序列進行同源性分析，獲得其特

7、異性保守序列，并將目標DNA分為6-8個獨立區(qū)域，用軟件Primer design V4針對該6-8個獨立區(qū)域設計分別得到用于對艱難梭菌tcdA與tcdB進行LAMP檢測的引物。②最佳引物篩查:通過對各組引物擴增效率的對比得出最佳引物組合。③最佳反應溫度篩查:以艱難梭菌標準株VPI10463的DNA提取液作為模板，分別設置58℃-69℃12個溫度梯度對最佳引物進行擴增，比較其擴增效率找出最佳反應溫度。④敏感性實驗:以艱難梭菌標準株VPI

8、10463的DNA提取液作為模板，用去離子水進行10倍系列稀釋，濃度從207 ng/μl到0.000207 pg/μl，分別用LAMP，PCR方法檢測，比較兩者敏感性。LAMP法同時使用實時濁度儀和鈣黃綠色法判讀結果。⑤特異性實驗:用艱難梭菌標準株VPI10463作為陽性對照，去離子水作為陰性對照，分別用艱難梭菌tcdA與tcdB的最佳引物擴增26株常見致病菌，分別用LAMP，PCR方法檢測。LAMP法同時使用實時濁度儀和鈣黃綠色法判讀

9、結果。⑥糞便標本檢測:對比LAMP法、PCR法和基因測序法檢測123份糞便標本tcdA攜帶情況，以及對比LAMP法、PCR法和細胞毒素中和試驗檢測糞便標本中艱難梭菌B毒素的攜帶情況。
　　2).環(huán)介導恒溫擴增法快速檢測艱難梭菌二元毒素基因。①引物的設計:通過BLAST軟件分別針對艱難梭菌二元毒素基因cdtA與cdtB重復序列進行同源性分析，獲得其特異性保守序列，并將目標DNA分為6-8個獨立區(qū)域，用軟件Primer design

10、V4針對該6-8個獨立區(qū)域設計分別得到用于對艱難梭菌cdtA與cdtB進行LAMP檢測的引物。②最佳引物篩查:通過對各組引物擴增效率的對比得出最佳引物組合。③最佳反應溫度篩查:以艱難梭菌標準株VPI10463的DNA提取液作為模板，分別設置57℃-64℃8個溫度梯度對艱難梭菌cdtA最佳引物進行擴增、設置57℃-68℃12個溫度梯度對艱難梭菌cdtB最佳引物進行擴增，比較其擴增效率找出最佳反應溫度。④敏感性實驗:以艱難梭菌標準株VPI1

11、0463的DNA提取液作為模板，用去離子水進行10倍系列稀釋，濃度從24.8ng/μl到0.000248pg/μl，分別用LAMP，PCR方法檢測，比較兩者敏感性。LAMP法同時使用實時濁度儀和鈣黃綠色法判讀結果。⑤特異性實驗:用艱難梭菌標準株VPI10463作為陽性對照，去離子水作為陰性對照，分別用艱難梭菌二元毒素基因cdtA與cdtB的最佳引物擴增25株常見致病菌，分別用LAMP，PCR方法檢測。LAMP法同時使用實時濁度儀和鈣黃綠

12、色法判讀結果。⑥糞便標本檢測:對比評價LAMP法和PCR法檢測123份糞便標本艱難梭菌cdtA與cdtB的攜帶情況。
　　結果：
　　1).LAMP法檢測艱難梭菌毒素特異基因tcdA的最佳引物是A12，最佳反應條件是:61℃，反應60min。LAMP法檢測艱難梭菌毒素特異基因tcdB的最佳引物是B0，最佳反應條件是:60℃，反應60min。同步檢測tcdA及tcdB的最佳反應條件是:60℃，反應60min。LAMP法只擴增攜

13、帶tcdA或tcdB基因的艱難梭菌，特異性良好。LAMP法對艱難梭菌毒素特異基因tcdA及tcdB的最低檢出限均為20.7pg/μl，靈敏度為PCR法的10倍（PCR為207pg/μl）?；驕y序法檢測123例糞便標本，艱難梭菌tcdA的陽性率為29.3％(36/123)，雖然LAMP法與PCR法的特異度無統(tǒng)計學差異，但是LAMP法的靈敏度、與基因測序的一致百分率均較PCR法高?！敖饦藴省?細胞毒素中和試驗檢測123例糞便標本，艱難梭菌

14、B毒素的陽性率為25.2％,而LAMP法與PCR法檢測糞便標本艱難梭菌B毒素的靈敏度、特異度均無統(tǒng)計學差異。
　　2).LAMP法檢測艱難梭菌二元毒素cdtA基因的最佳引物是A2，最佳反應條件是:60℃恒溫90min;檢測cdtB的最佳引物是B4，最佳反應條件是:63℃恒溫90min;同步檢測cdtA和cdtB的最佳反應條件為:61℃恒溫90min。LAMP法只擴增攜帶cdtA和cdtB基因的艱難梭菌，特異性良好。LAMP法對艱難