環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌新型試劑盒研制項(xiàng)目實(shí)施方案報(bào)告

1、 一、選題的必要性1、項(xiàng)目所處技術(shù)領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)政策本項(xiàng)目屬生物高技術(shù)領(lǐng)域，是國(guó)家重點(diǎn)支持的研究領(lǐng)域，項(xiàng)目主要針對(duì)嚴(yán)重影響人類健康的主要病原菌的檢測(cè)與診斷需要進(jìn)行檢測(cè)技術(shù)的研究與試劑盒的開發(fā)，本項(xiàng)目的實(shí)施可產(chǎn)生具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的科研成果。本項(xiàng)目技術(shù)含量高，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)，項(xiàng)目完成后能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，項(xiàng)目符合國(guó)家產(chǎn)業(yè)、技術(shù)政策。2、項(xiàng)目所處技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀目前的病原菌檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、

2、準(zhǔn)確性低，開發(fā)快速、準(zhǔn)確、低成本的檢測(cè)技術(shù)和配套試劑是病原菌檢測(cè)工作中亟待攻克的難題。本項(xiàng)目針對(duì)病原菌檢測(cè)中存在的問題，采用高靈敏度、高特異性的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)開發(fā)出簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)試劑。3、項(xiàng)目技術(shù)先進(jìn)性，對(duì)相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)進(jìn)步的推動(dòng)作用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是利用 4 個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DNA 聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增 DNA 的新技術(shù)。該技術(shù)在 1h 內(nèi)能擴(kuò)增出 109 靶序列拷貝。LAMP 技術(shù)以其

3、特異性強(qiáng)、設(shè)計(jì)了部分引物，現(xiàn)正通過實(shí)驗(yàn)確定這些引物的性能。（2）本項(xiàng)目的另一技術(shù)關(guān)鍵是最佳等溫?cái)U(kuò)增體系優(yōu)化。通過對(duì)引物濃度、內(nèi)引物和外引物的最佳濃度比、模板濃度、dNTP 濃度、BstDNA 聚合酶用量、Mg2+濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，能夠獲得最佳實(shí)驗(yàn)條件。2、創(chuàng)新點(diǎn)（1）既往對(duì)病原菌的檢測(cè)一般采用細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定法，但該方法的準(zhǔn)確率低，所需時(shí)間長(zhǎng)，往往延誤臨床正確的診斷和治療。近年來，人們將 PCR 技術(shù)用于病原菌的檢測(cè)。PCR 技術(shù)雖然

4、較傳統(tǒng)方法靈敏、快速，但需要較昂貴的儀器設(shè)備。更為重要的是，PCR 方法容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，造成假陽性和假陰性結(jié)果，影響對(duì)樣品的正確判斷。本項(xiàng)目將建立適合于食品和臨床標(biāo)本大規(guī)模檢測(cè)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌技術(shù)。與目前的檢測(cè)方法相比，等溫?cái)U(kuò)增法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。而且，等溫?cái)U(kuò)增法是在恒溫下進(jìn)行，只需一個(gè)簡(jiǎn)單的恒溫裝置，不需要 PCR 實(shí)驗(yàn)中的昂貴儀器，因而易于在基層食品質(zhì)量檢測(cè)部門和醫(yī)院推廣使用。（2）目前，國(guó)外已有將