萬(wàn)州獼猴桃潰瘍病病原菌的分離鑒定及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè).pdf

1、獼猴桃潰瘍病是一種對(duì)獼猴桃產(chǎn)業(yè)威脅重大的毀滅性病害。目前，該病害在國(guó)內(nèi)外均有發(fā)生。重慶作為種植獼猴桃的主產(chǎn)區(qū)，近年來(lái)也飽受潰瘍病的為害。
　　為了使重慶的獼猴桃潰瘍病病原菌種類與特征得以明確，更好地為檢疫和防治當(dāng)?shù)夭『μ峁├碚撘罁?jù)，本研究從重慶萬(wàn)州孫家鎮(zhèn)、響水鎮(zhèn)和鐵峰鄉(xiāng)的不同果園采集感染潰瘍病的紅陽(yáng)獼猴桃枝條、葉片等，分離其病原菌，運(yùn)用傳統(tǒng)的表型測(cè)定、生理生化測(cè)定和致病性測(cè)定等，結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)病原菌進(jìn)行詳細(xì)鑒定?；讷J猴桃潰

2、瘍病菌的avrD1基因設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化各種參數(shù)，建立了獼猴桃潰瘍病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)檢測(cè)方法，為病害在田間的快速診斷奠定了基礎(chǔ)。主要研究成果如下：
　　傳統(tǒng)方法對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌的鑒定：本研究從采集的病組織上共分離純化得到10株病原物，分別將其命名為CQPsa-01至CQPsa-10。這些菌株的形態(tài)特征基本上相同，在KBA培養(yǎng)基上均表現(xiàn)為圓形、奶

3、白色、全緣、微凸、表面光滑，半透明等。革蘭氏染色結(jié)果表明分離細(xì)菌為革蘭氏陰性菌。以陜西菌株M7作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，對(duì)分離的10個(gè)菌株進(jìn)行培養(yǎng)性狀和生理生化測(cè)定，結(jié)果表明，在所有測(cè)試指標(biāo)中，這些分離菌株與M7結(jié)果完全一致。對(duì)10個(gè)菌株進(jìn)行致病性測(cè)定，所有菌株均可使煙草葉片產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，接種供試菌株的獼猴桃枝條和葉片，在一定條件下培養(yǎng)后均發(fā)病，發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病的典型癥狀一致，再次分離后獲得一致的病原，完成了柯赫氏法則證病。
　　分子方

4、法對(duì)獼猴桃潰瘍病病原菌的鑒定：利用細(xì)菌16SrDNA片段的通用引物27F/1492R，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株M7和分離的10株病原物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并以擴(kuò)增片段序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示菌株M7和10株病原物與丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae,Psa)JN378726.1菌株的親緣關(guān)系最近，但是不能與丁香假單胞菌茶致病變種(P.syringaepv.theae)區(qū)分。利用特

5、異性引物PsaF1/R2、KNF/KNR和AvrDdpx-F/R分別對(duì)M7菌株和10株病原物進(jìn)行RG-PCR和雙重PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果表明所有菌株都擴(kuò)增出大小分別約為280bp、492bp和226bp的目的條帶，由于在所有Psa的近緣種中，雙重PCR僅能對(duì)Psa同時(shí)擴(kuò)增出兩條目的條帶，所以可以確定本實(shí)驗(yàn)分離的10個(gè)菌株均為Psa。利用根據(jù)陜西Psa菌株設(shè)計(jì)的引物ChinaF/R和根據(jù)四川Psa菌株設(shè)計(jì)的引物F7’/R7’分別對(duì)M7菌

6、株和10株病原物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果表明ChinaF/R僅對(duì)3個(gè)菌株M7、CQPsa-08和CQPsa-10擴(kuò)增出一條609bp左右的目的條帶，而對(duì)其它CQPsa菌株不擴(kuò)增或擴(kuò)增出2-5條非特異性條帶；F7’/R7’對(duì)M7菌株和10株病原物均擴(kuò)增出很多條基本一致的非特異性條帶。以上結(jié)果說(shuō)明陜西Psa、四川Psa和重慶Psa的某些基因存在差異，且重慶萬(wàn)州的Psa菌株之間也存在差異。
　　獼猴桃潰瘍病病原菌LAMP快速檢測(cè)方法的建

7、立：根據(jù)Psa的avrD1基因用PrimerExplorerV4軟件設(shè)計(jì)引物，初步建立LAMP反應(yīng)體系，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，最終建立了Psa的LAMP快速檢測(cè)方法。產(chǎn)物通過(guò)觀察白色沉淀和SYBRGreenI染色后的顏色變化，可以直接判定樣品的檢測(cè)結(jié)果。以分離自獼猴桃的23種內(nèi)生細(xì)菌和其他幾種植物病原菌為陰性對(duì)照菌株，對(duì)LAMP引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果顯示只有Psa菌株能擴(kuò)增出特征性梯狀條帶，而其他所有的陰性對(duì)照菌株均未擴(kuò)增出任何條帶，說(shuō)明設(shè)

8、計(jì)的LAMP引物的特異性較好。分別以Psa菌株的基因組DNA和菌液為模板，利用雙重PCR、定量PCR和LAMP3種方法進(jìn)行靈敏度比較試驗(yàn)，結(jié)果表明LAMP和定量PCR的檢出限均為5fg(10CFU/PCR)，比雙重PCR高出1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。分別利用雙重PCR、定量PCR和LAMP對(duì)34個(gè)采自田間和2個(gè)實(shí)驗(yàn)室接種的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明在所有未感染獼猴桃潰瘍病的樣品中，雙重PCR和LAMP技術(shù)對(duì)所有樣品均未擴(kuò)增出條帶；在所有自然感染獼

9、猴桃潰瘍病的顯癥樣品和人工接種的葉片和枝條樣品中，雙重PCR和LAMP技術(shù)對(duì)所有樣品均可擴(kuò)增出特異性條帶；在所有自然感染獼猴桃潰瘍病的無(wú)癥樣品中，雙重PCR僅對(duì)16號(hào)樣品擴(kuò)增出了兩條目的條帶，而LAMP則對(duì)所有樣品擴(kuò)增出特征性梯狀條帶。定量PCR對(duì)所有樣品的擴(kuò)增結(jié)果與LAMP擴(kuò)增結(jié)果相同，從而驗(yàn)證了LAMP方法具有與實(shí)時(shí)熒光定量PCR基本一致的高靈敏度和準(zhǔn)確性。
　　綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，本研究可得出如下結(jié)論：
　　1)分離自重