獼猴桃軟腐病病原學(xué)研究.pdf

1、四川是獼猴桃種植大省，種植歷史悠久，2011年年產(chǎn)量約為13萬(wàn)噸。獼猴桃軟腐病是貯藏期危害最為嚴(yán)重的病害，發(fā)病迅速且難于防治。有關(guān)獼猴桃軟腐病的研究尚處于初始階段，其病原種類(lèi)、致病機(jī)制和發(fā)病果實(shí)的生理物質(zhì)變化等報(bào)道甚少?；谝陨显颍菊撐膶?duì)該病病原物進(jìn)行了系統(tǒng)研究并獲得以下結(jié)果:
　　從四川省蒼溪、都江堰、名山、彭州、邛崍和雙流等地的發(fā)病獼猴桃果實(shí)上共分離到135株Botryosphaeriaceae科真菌。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征

2、以及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribed space，ITS)、翻譯延長(zhǎng)因子(transcription elongation factor1-α，TEF)和β-微管蛋白(β-tubulin，BT)序列將病原菌鑒定為Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodiatheobromae和Neofusicoccum parvum其中L.theobromae和N.parvum是第一次報(bào)道為該病的病原物

3、。研究也發(fā)現(xiàn)B.dothidea能以分生孢子器和假囊殼越冬，越冬的分生孢子和子囊孢子與從果實(shí)上分離的3種病原菌（B.dothidea、L.theobromae和N.parvum）一樣，均能危害果實(shí)、葉片和枝條，表明越冬的B.dothidea分生孢子和子囊孢子為獼猴桃軟腐病的初侵染源。病原菌生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，3種病原菌（Botryosphaeriadothidea、Lasiodiplodia theobromae和Neofusico

4、ccum parvum）的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的最適溫度為25～30℃。菌絲生長(zhǎng)最適pH值為5～8，而孢子萌發(fā)最適pH值為6～8。不同病原菌對(duì)碳源和氮源的利用程度不盡相同。Neofusicoccum parvum的最適碳源是木糖， Botryosphaeria dothidea和Lasiodiplodia theobromae的最適碳源為葡萄糖。氮源利用試驗(yàn)表明，NH4Cl為N.parvum和B.dothidea的最適氮源，而L.theo

5、bromae的最適氮源為谷氨酸。
　　對(duì)37株Botryosphaeria dothidea，2株Lasiodiplodia theobromae和13株Neofusicoccum parvum，共52株分離物進(jìn)行致病力測(cè)定和遺傳多樣性分析。結(jié)果表明它們均能造成果實(shí)發(fā)病，但致病力有明顯差異。對(duì)于B.dothidea種類(lèi)來(lái)說(shuō)，弱致病力菌株占29.73％（11株），中致病力菌株占43.24％（16株），強(qiáng)致病力菌株占27.03％(10

6、株)。同樣，中致病力菌株在N.parvum類(lèi)群中所占比例也最高(53.85％)，弱致病力菌株占7.69％（1株），強(qiáng)致病力菌株占38.46％（5株）。2株L.theobromae均為強(qiáng)致病力菌株。利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記(inter-simple sequence repeats，ISSR)和相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（Sequence Related Amplified Polymorphism，SRAP）分析這52株病原菌的多

7、樣性。9個(gè)ISSR引物共擴(kuò)增出128條譜帶，其中多態(tài)性條帶為86條，占總條帶數(shù)的67.19％，每對(duì)引物平均獲得9.56條。8對(duì)SRAP引物組合共擴(kuò)增出114條譜帶，其中多態(tài)性條帶為78條，占總條帶數(shù)的68.42％，每對(duì)引物平均獲得9.75條。在遺傳距離約0.645處，9個(gè)ISSR分子標(biāo)記可將獼猴桃軟腐病菌劃分為3個(gè)大類(lèi):類(lèi)群Ⅰ所有菌株為B.dothidea（37個(gè)菌株）;類(lèi)群Ⅱ所有菌株均為N.parvum（括13個(gè)菌株）;而類(lèi)群Ⅲ只有2

8、個(gè)菌株，它們均為L(zhǎng).theobromae。在0.798處類(lèi)群Ⅰ分為5個(gè)組。在0.708處類(lèi)群Ⅱ分為3個(gè)組。在0.996處類(lèi)群Ⅲ各分為兩個(gè)菌株，均為L(zhǎng).theobromae。8對(duì)SRAP分子標(biāo)記在遺傳距離約0.608處，可將獼猴桃軟腐病菌劃分為2個(gè)大類(lèi):類(lèi)群Ⅰ所有菌株為B.dothidea（37個(gè)菌株）;類(lèi)群Ⅱ包括13個(gè)N.parvum菌株和2個(gè)L.theobromae菌株。在0.779處類(lèi)群Ⅰ分為7個(gè)組，在0.77處類(lèi)群Ⅱ分為6個(gè)組，其

9、中1至5個(gè)組均由N.parvum菌株構(gòu)成，第6個(gè)組由兩株L.theobromae菌株構(gòu)成。綜合結(jié)果表明，來(lái)源于四川省6個(gè)地區(qū)的獼猴桃軟腐病菌的遺傳多樣性與致病性強(qiáng)弱及地理來(lái)源并無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系。
　　對(duì)獼猴桃軟腐菌致病因子研究結(jié)果表明，B.dothidea能在PDA、Fries與Czapek培養(yǎng)液中產(chǎn)生毒素，但在Fries與Czapek培養(yǎng)液中產(chǎn)生的毒素活性更強(qiáng)。在光暗交替振蕩條件下病原菌產(chǎn)生的毒素活性明顯強(qiáng)于黑暗振蕩培養(yǎng)中產(chǎn)生的毒

10、素活性。利用丙酮提取的毒素活性高于用甲醇+氯仿提取的活性。致病性測(cè)定結(jié)果表明，B.dothidea、Lasiodiplodia theobromae和Neofusicoccum parvum產(chǎn)生的毒素、果膠酶及纖維素酶能對(duì)獼猴桃果實(shí)和葉片產(chǎn)生傷害。
　　根據(jù)Neofusicoccum parvum的目的纖維素酶基因和看家基因序列，設(shè)計(jì)了ubiquitinconjugating enzyme(ubcB)、Beta-tubulin(β

11、-tub)和RNA polymerase iii transcription factor(TFC1)3個(gè)看家基因的特異性引物，和6對(duì)跨內(nèi)含子和1對(duì)不跨內(nèi)含子（基因無(wú)內(nèi)含子）的纖維素酶基因的特異性引物。結(jié)果表明，由這3個(gè)看家基因作為參照分別計(jì)算出來(lái)的7個(gè)纖維素酶基因的表達(dá)量趨勢(shì)高度一致，但是由TFC1作為參照計(jì)算出來(lái)的7個(gè)纖維素酶基因表達(dá)量均高于其它兩個(gè)看家基因作為參照時(shí)的表達(dá)量。在6d的侵染過(guò)程中，UCRNP2_2427和UCRNP2

12、_7122纖維素酶基因的表達(dá)量為先下降后上升再下降又再上升的W型趨勢(shì)，UCRNP2_2356、UCRNP2_5067和UCRNP2_7847纖維素酶基因的表達(dá)量趨勢(shì)為先下降后上升，呈U型趨勢(shì)， UCRNP2_3883的表達(dá)量趨勢(shì)為先上升后下降的倒Ⅴ型，而UCRNP2_8897的表達(dá)量趨勢(shì)則為先下降再上升然后再下降。對(duì)于7個(gè)基因來(lái)說(shuō)，UCRNP2_2427基因的表達(dá)量在第1d最低，而UCRNP22356最高;UCRNP2_5067的表達(dá)量

13、在第2、3和4d最低，而UCRNP23883表達(dá)量在第2d最高，但是UCRNP2_2356在第3和4d最高;UCRNP2_2427和UCRNP2_5067在第5d表達(dá)量一樣，均為最低，而在同一天UCRNP2_2356的表達(dá)量最高;在第6d時(shí)，UCRNP2_2356表達(dá)量最高，而UCRNP2_3883表達(dá)量最低。
　　根據(jù)B.dothidea的ITS序列設(shè)計(jì)了一對(duì)用于特異擴(kuò)增該病原菌的引物BZY-1/BZY-2。除B.dothide

14、a能擴(kuò)增出目標(biāo)片段外，該對(duì)引物對(duì)參試的其它25屬真菌均不能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶。該引物不僅能從接種B.dothidea的果實(shí)里擴(kuò)增出特異性條帶，并且也能從自然發(fā)病的果實(shí)中擴(kuò)增出B.dothidea特有的條帶，而健康果實(shí)則未有任何條帶。
　　對(duì)水楊酸和生防菌Lecythophora luteoviridis發(fā)酵液誘導(dǎo)獼猴桃抗軟腐病的研究結(jié)果表明，水楊酸和L.luteoviridis的無(wú)菌發(fā)酵液浸泡獼猴桃果實(shí)后，能使果實(shí)發(fā)病時(shí)間延遲。利用

15、水楊酸和L.luteoviridis發(fā)酵液誘導(dǎo)果實(shí)后，在6d內(nèi)連續(xù)測(cè)量獼猴桃果實(shí)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)的變化結(jié)果表明，這5種物質(zhì)在不同處理中有不同的變化趨勢(shì)。但是大多數(shù)情況下接種病原菌的果實(shí)CAT、POD、SOD、 Pro和MDA含量均比不接種病原菌的高。蒸餾水浸泡果實(shí)后接種病原菌的果實(shí)CAT、POD、SOD、 Pro和MDA在大多數(shù)情況下均比其它處理的高