獼猴桃潰瘍病相關(guān)細(xì)菌的鑒定及致病性研究.pdf

1、獼猴桃潰瘍病是一種世界性的侵染獼猴桃的細(xì)菌性病害,該病害危害極大,嚴(yán)重時(shí)可致使全園毀滅,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病害在中國(guó)、日本、韓國(guó)、意大利、新西蘭等主要獼猴桃種植國(guó)家均有發(fā)生。目前獼猴桃潰瘍病在我國(guó)獼猴桃產(chǎn)區(qū)的發(fā)生呈上升趨勢(shì),個(gè)別年份甚至大流行。由于我國(guó)對(duì)獼猴桃潰瘍病的病原缺乏系統(tǒng)的研究,因此,本研究分別在安徽、陜西、重慶等地獼猴桃果園重病區(qū)采集病樣,對(duì)該病害的相關(guān)細(xì)菌進(jìn)行了分離,并對(duì)其做了表型鑒定、分子特征分析以及致病性測(cè)定等研究。

2、主要研究結(jié)果如下:
　　1.獼猴桃潰瘍病相關(guān)細(xì)菌的分離及表型鑒定本研究采用研磨稀釋分離法分別用三種培養(yǎng)基對(duì)采集的病樣進(jìn)行分離,共得到328株出現(xiàn)頻率高并具有代表性的菌株,這些菌落在BPA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的形態(tài)有三類:一類是菌落呈白色,圓形隆起,邊緣呈光滑的波浪狀,共311株。其中有282株革蘭氏染色為陰性,能動(dòng),好氧,LOPAT試驗(yàn)為(++–++),七葉苷水解和明膠液化試驗(yàn)為陽(yáng)性,能利用葡萄糖產(chǎn)酸,能利用葡萄糖,蔗糖,海藻糖,纖維二糖

3、,乳糖,麥芽糖,并且能在KB培養(yǎng)基上產(chǎn)熒光色素,初步鑒定為熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens。另29株革蘭氏染色為陰性,兼性厭氧,能動(dòng),LOPAT試驗(yàn)為(+–––+),產(chǎn)熒光色素試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)均為陰性,過(guò)氧化氫酶反應(yīng)和七葉苷水解試驗(yàn)為陽(yáng)性。第二類是菌落黃色,圓形光滑,全緣。第三類是菌落初呈乳白色,后產(chǎn)生黃色素,菌落生長(zhǎng)快。
　　2.獼猴桃潰瘍病相關(guān)細(xì)菌的分子特征分析
　　利用丁香假單胞獼猴桃致病變種

4、的特異性引物PsaF1/R2、PsaF3/R4,對(duì)125株細(xì)菌的全基因組DNAITS區(qū)域進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增,凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明僅意大利提供的P.syringaepv.actinidiae菌株F285、Fc84、F28c在175bp和280bp左右的位置檢測(cè)到兩條擴(kuò)增片段,分離所得細(xì)菌均未檢測(cè)到目的片段。
　　利用細(xì)菌16SrRNA片段通用引物P1F/P2R,對(duì)125株細(xì)菌全基因組DNA做PCR擴(kuò)增,均得到一條大小約為1500bp

5、目的片段,分別用限制性內(nèi)切酶HaeIII和MSPI對(duì)16SrRNA-PCR擴(kuò)增片段酶切,酶切圖譜顯示,內(nèi)切酶HaeIII將菌株分為四類,MSPI將菌株分為五類,酶切結(jié)果與菌株的表型鑒定結(jié)果大體一致。選取14株代表性細(xì)菌,將其16SrRNA-PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行T/A克隆、序列測(cè)定,對(duì)獲得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast搜索,結(jié)果顯示意大利提供的P.syringaepv.actinidiae菌株F285、Fc84、F28c的16SrRN

6、A片段與P.s.pv.actinidiae同源性達(dá)99％,菌株AHK-1、AHK-2、A1-3、A2-1、A2-2與P.fluorescens同源性達(dá)99%,菌株A17、F-7與Rahnellaspp.同源性達(dá)99%,菌株C101、AL-3與Xanthomonaspp.同源性達(dá)99%,菌株B-2、C-3與Pantoeaagglomerans同源性達(dá)99%。
　　采用假單胞菌屬I(mǎi)TS間隔區(qū)通用引物D21/D22,對(duì)14個(gè)代表性細(xì)菌全

7、基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果表明:P.s.pv.actinidiae和P.fluorescens在600bp左右的位置檢驗(yàn)出單一條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。Rahnellaspp.,Xanthomonaspp.和Pantoeaagglomerans進(jìn)行ITS序列的PCR擴(kuò)增未檢測(cè)到目標(biāo)片段。將假單胞屬細(xì)菌ITS區(qū)域擴(kuò)增片段進(jìn)行T/A克隆測(cè)序,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示AHK-1,AHK-5A1-3,A2-1,A2-2菌株的rRNA

8、-ITS序列與P.fluorescens菌株A506,62e和2313的同源性高達(dá)97%~99%,菌株F285、Fc84、F28c的rRNA-ITS序列與P.s.pv.actinidiae菌株P(guān)A835和Kw-11的同源性為99%。對(duì)獲得序列與已知細(xì)菌的ITS序列進(jìn)行聚類分析,結(jié)果顯示P.fluorescens和P.syringae,P.avellanae屬不同的分支(89%bootstrapsupport),而本實(shí)驗(yàn)分離所得的Pseu

9、domonas菌株與P.fluorescens緊密相鄰(95%bootstrapsupport),意大利提供的P.s.pv.actinidiae菌株與P.s.pv.actinidiae相近(63%bootstraplevel)。
　　3.獼猴桃潰瘍病相關(guān)細(xì)菌的致病性測(cè)定將14個(gè)代表性細(xì)菌菌株制成107~108CFU/mL菌懸液,分別接種煙草葉片、離體健康獼猴桃植株的1~2年生枝條、嫩梢以及活體獼猴桃植株的嫩梢和葉片。觀察發(fā)現(xiàn),除P

10、antoeaagglomerans引起的煙草葉片過(guò)敏性反應(yīng)較弱,其它菌株包括Rahnellaspp.,Xanthomonasspp.,P.fluorescens和P.s.pv.actinidiae均能引起煙草葉片產(chǎn)生過(guò)敏性枯斑;但是僅只有P.fluorescens和P.s.pv.actinidiae菌株能引起獼猴桃枝條、嫩梢以及葉片發(fā)病,其他菌株與無(wú)菌水對(duì)照接種部位無(wú)明顯發(fā)病癥狀,通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證,從發(fā)病的組織上成功分離到P.fluo