獼猴桃細菌性潰瘍病菌gacA基因的克隆及功能分析.pdf

1、丁香假單胞獼猴桃致病變種(Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa)引起的細菌性潰瘍病是獼猴桃生產上一種毀滅性細菌性病害，該病害于1980年首次發(fā)現(xiàn)在美國加利福尼亞和日本靜岡縣，隨后蔓延至新西蘭、意大利、中國等地，此病害的流行給獼猴桃產業(yè)的發(fā)展造成重大的經濟損失。gacA基因是一類廣泛存在于革蘭氏陰性細菌中的調控因子，調控著細菌的毒性及次生代謝產物。Psa在寄主選擇類型及致病流行條件方面與其他丁香假

2、單胞細菌具有很大差異，然而，至今關于gacA基因在獼猴桃潰瘍細菌致病中的作用機制尚未見報道。因此本研究根據(jù)已知的丁香假單胞番茄致病變種(P. s. pv. tomato)中調控基因 gacA的序列,利用生物信息學手段,從獼猴桃潰瘍菌的全基因組中克隆出 gacA基因的同源基因。然后采用同源重組的方法構建 gacA基因的缺失突變體及回復突變體，并對其功能進行初步分析。研究內容如下：
　　1.獼猴桃潰瘍病菌gacA基因的克隆及生物信息學

3、分析根據(jù)來源于假單胞菌屬（Pseudomonas syringae）、芽孢桿菌屬（Bacillus Cohn）、黃單胞菌屬（Xanthomonas Campestris）、歐文氏菌屬（Erwinia amylovora）已報道的gacA基因，利用CLUSTALX軟件進行序列分析，分析結果表明假單胞菌屬中gacA基因高度同源，相似性達98％。以獼猴桃潰瘍病菌野生型菌株AHP-18為供試菌株，根據(jù)假單胞菌屬中gacA基因的保守序列，設計特異

4、性引物gacA3/gacA4,克隆得到gacA基因，測序驗證正確后，在NCBI上對測序結果進行分析。
　　利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)對Psa的GacA蛋白序列的進行結構域分析。結果表明，Psa中GacA具有 GacA相似蛋白的結構，GacA蛋白的 N端具有一個 REC結構域,主要作用是接受信號感受蛋白傳遞來的磷酸基團；C端具有HTH結構，負責多極化以及和啟動子DNA結合。

5、r>　　2.獼猴桃潰瘍病菌gacA基因缺失突變體的構建及篩選采用同源雙交換的方法對獼猴桃潰瘍病菌的 gacA基因進行缺失突變，首先設計特異性引物（gac-1U/gac-1R、gac-2U/gac-2R)擴增出 gacA基因的上下游同源臂片段，為了降低篩選突變株的難度，同時引入氯霉素抗性片段然后采用融合PCR技術構建融合片段作為外源目的片段，測序驗證正確后，與自殺載體pK18mobsacB相連，構建重組載體pK18gacA。本研究基于三親

6、結合技術將重組載體轉入野生型菌株 AHP-18中，經過同源單交換，得到260株 gacA基因單交換菌株，從單交換菌株中篩選得到雙交換菌株20株，即為 gacA基因的缺失突變株。
　　3.ΔgacA功能互補菌株的構建及篩選設計特異性引物對（gac-F/gac-R)從菌株 AHP-18擴增出要補入的基因片段，并且在片段兩端同時引入合適的酶切位點（PstI/BamHI),將擴增的外源片段及廣宿主質粒pLAFR3分別酶切，然后以3:1進行

7、連接，構建互補重組載體，然后基于三親結合技術將重組載體導入突變株△gacA基因組中，利用四環(huán)素抗性篩選得到陽性克隆，然后進行菌落PCR驗證，正確的即為互補菌株。
　　4.獼猴桃潰瘍病菌gacA基因的功能分析將野生型菌株、突變型菌株及恢復突變株分別接種獼猴桃活體枝條、離體葉片和煙草葉片，研究gacA基因的生物學功能。試驗結果表明，gacA基因參與調控了病菌的毒素和胞外酶合成，病菌的游動能力及致病性等，該基因的缺失導致病菌的產phas