瓜類細(xì)菌性果斑病菌致病相關(guān)基因篩選及l(fā)uxR基因功能分析.pdf

1、瓜類細(xì)菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp.citrulli，Aac）引起的瓜類細(xì)菌性果斑?。╞acterial fruit blotch，BFB）是葫蘆科植物上的一種毀滅性的細(xì)菌病害，嚴(yán)重影響果品和產(chǎn)量。近年來在我國許多地區(qū)均有報道，尤其作為哈密瓜主要產(chǎn)區(qū)的新疆等地，該病的發(fā)生對于哈密瓜產(chǎn)業(yè)具有極大的威脅。盡管BFB對經(jīng)濟有重要作用，但是目前關(guān)于它的病原物的生物學(xué)以及與寄主植物互作的分子方面仍知之甚少，因此研究

2、瓜類細(xì)菌性果斑病菌的致病相關(guān)基因及其機理對于病害防治致關(guān)重要。
　　 鑒于此，我們幾經(jīng)嘗試試圖通過構(gòu)建Aac轉(zhuǎn)座子隨機插入突變體文庫，來尋找Aac中與致病相關(guān)的基因，然而由于Aac菌體本身一些特性使得對Aac進(jìn)行遺傳操作十分困難。經(jīng)過不斷改進(jìn)實驗方案，我們終于通過三親交配原理成功建立了Aac xjL12菌株的轉(zhuǎn)座子（Mini-Tn5）隨機插入突變體文庫。通過接種哈密瓜幼苗來篩選致病性發(fā)生變化的突變體，成功的得到了三株致病性喪失和

3、一株致病性明顯減弱的突變體，利用亞克隆技術(shù)鑒定了轉(zhuǎn)座子插入位點，得到致病相關(guān)基因。同時我們也通過構(gòu)建其中一個基因的插入失活突變體△araC，接種哈密瓜幼苗后發(fā)現(xiàn)△araC致病性完全喪失，這與轉(zhuǎn)座子插入得到突變體結(jié)果是完全一致的。
　　 此外，本研究還對Aac中群體感應(yīng)系統(tǒng)（Quorum Sensing，QS）luxR同源基因進(jìn)行功能研究。目前已知群體感應(yīng)系統(tǒng)能夠調(diào)控著對動植物的毒性因子，而毒性因子的產(chǎn)生與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)。本

4、課題組已報道Aac能夠產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子，為了進(jìn)一步研究Aac的群體感應(yīng)信號分子的相關(guān)基因以及與致病性的相關(guān)性，本研究從群體感應(yīng)信號分子的合成底物和信號分子的靶細(xì)胞為出發(fā)點，從Aac全基因組中找到了三個可能與信號分子相關(guān)的基因：luxR（LuxR family transcriptional regulator），acP（3-oxoacyl-（ACP）synthaseⅢ），acD（acyl-CoA dehydrogenase doma

5、in-containingprotein），通過同源重組的方法分別構(gòu)建了突變株。通過致病性實驗和AHL檢測分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，△luxR致病性有所下降，產(chǎn)生信號分子的能力減弱，而△acP和△acD沒有明顯變化。因此，我們對△luxR進(jìn)行了進(jìn)一步的驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)△luxR能夠產(chǎn)生液滴坍塌現(xiàn)象，對抗生素耐受水平有所提高，并且對哈密瓜幼苗的致病能力下降，RT-PCR實驗結(jié)果表明，luxR基因的缺失對luxI基因的表達(dá)有抑制作用，從而證明了