水稻細(xì)菌性條斑病菌中群體感應(yīng)信號(hào)途徑中三個(gè)相關(guān)基因的功能分析.pdf

1、水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae）包括兩個(gè)致病變種，分別是水稻白葉枯病菌（X.oryzae pv.oryzae，簡(jiǎn)稱Xoo）和水稻細(xì)菌性條斑病菌（X.oryzae pv.oryzicola，簡(jiǎn)稱Xoc），二者分別在水稻（Oryza sativa）上引起白葉枯病和細(xì)菌性條斑病。目前，細(xì)菌性條斑病已嚴(yán)重威脅到熱帶和亞熱帶地區(qū)的水稻種植。依賴可擴(kuò)散信號(hào)分子（diffusible signal factor, DSF）的群體感

2、應(yīng)(Quorum sensing，QS)系統(tǒng)是黃單胞屬細(xì)菌生物學(xué)功能全局性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，在群體水平上調(diào)控病原菌的毒性因子表達(dá)、生物膜形成等重要生物學(xué)功能。目前已有研究證明，DSF信號(hào)分子合成和傳導(dǎo)與rpf基因簇及全局性調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Clp密切相關(guān)，在野油菜黃單胞菌（X.campestrispv campestris，簡(jiǎn)稱Xcc）中，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)還包括受Clp調(diào)控的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子TetR家族的FhrR和鋅吸收調(diào)控蛋Zur(zinc

3、 uptake regulator)。
　　 本研究目的在于闡明Xoc中，群體感應(yīng)信號(hào)途徑中類似于調(diào)控因子FhrR和Zur的兩個(gè)基因fhrR、zur以及天冬酰胺合成酶基因（asparagine synthetase B，asnB）的生物學(xué)功能，以及利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，分析這些基因在群體感系統(tǒng)中的調(diào)控地位。
　　 1.通過PCR擴(kuò)增的方法從Rs105基因組中克隆到fhrR、zur基因，并證實(shí)二者在基因組中均為單拷

4、貝。采用同源重組的方法，構(gòu)建fhrR、zur的缺失突變體及其互補(bǔ)菌株。測(cè)定突變體及互補(bǔ)菌株的菌體形態(tài)、運(yùn)動(dòng)性、致病性和對(duì)過氧化氫的耐受性等多種表型;為進(jìn)一步明確fhrR、zur兩個(gè)調(diào)控因子在群體感應(yīng)調(diào)控體系中的地位，利用實(shí)驗(yàn)室已有菌株（△rpfF和△clp）構(gòu)建過表達(dá)菌株，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法探明fhrR、zur在各菌株轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。與野生型菌株相比，fhrR、zur缺失突變體的生長(zhǎng)能力并未受到明顯影響，但其

5、運(yùn)動(dòng)性以及對(duì)葡萄糖的趨化應(yīng)答反應(yīng)有明顯降低;fhrR缺失突變體的致病性升高，而zur基因的缺失則引起致病性顯著降低，qRT-PCR結(jié)果表明fhrR，zur基因的缺失對(duì)目前已報(bào)道的致病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)有一定影響。qRT-PCR結(jié)果顯示，fhrR、zur基因在△clp中轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，這表明，fhrR、zur受全局性調(diào)控因子Clp正向調(diào)控，由此可推斷，群體感應(yīng)系統(tǒng)通過調(diào)控fhrR、zur基因表達(dá)，從而影響細(xì)菌性條斑病菌的致病性等表型。<

6、br>　　 2.通過PCR擴(kuò)增的方法從Rs105基因組中克隆到asnB基因，并證實(shí)該基因在基因組中為單拷貝。采用同源重組的方法，構(gòu)建asnB的缺失突變體及其互補(bǔ)菌株，測(cè)定突變體及互補(bǔ)菌株的菌體形態(tài)、運(yùn)動(dòng)性、致病性及過敏性反應(yīng)等表型，證明asnB基因的缺失使條斑病菌喪失致病性，并且嚴(yán)重影響病菌對(duì)不同氮源的吸收能力（見殷芳群畢業(yè)論文）。本文為進(jìn)一步闡明asnB基因的生理功能及致病機(jī)制，通過多種表型測(cè)定以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)其進(jìn)行了

7、研究。結(jié)果表明asnB與Xoc對(duì)過氧化氫的耐受性有直接聯(lián)系，qRT-PCR結(jié)果顯示，在asnB缺失突變體中，抗氧化相關(guān)基因和致病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量都較野生型顯著降低，推測(cè)asnB可能通過影響病菌對(duì)氧迸發(fā)的耐受性而影響其致病性;asnB基因在△rpfF和△clp中轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，這表明，asnB受DSF和全局調(diào)控因子Clp正向調(diào)控;另一方面，通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)Xoc基因組中xoc_2999（asnB2）亦編碼天冬酰胺合成酶，且該基因在黃單胞