玉米大斑病菌黑色素合成途徑相關(guān)基因的克隆及功能分析.pdf

1、DHN黑色素在子囊菌和半知菌中廣泛存在，具有保護(hù)微生物免受紫外線和溶菌酶的作用，也是某些植物和動(dòng)物病原真菌的致病相關(guān)因子。研究表明，沉積在病菌附著胞壁上的黑色素，保證了病菌能夠產(chǎn)生足夠的膨壓穿透寄豐組織致病。本文利用候選基因法克隆了4個(gè)玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)黑色素合成途徑相關(guān)基因，其中包括1個(gè)還原酶基因(St3HNR)，2個(gè)漆酶基因(StLAC1和StLAC2)和1個(gè)調(diào)節(jié)基因(StMR)，它們分別與已知

2、絲狀真菌的相應(yīng)基因具有較高的相似性。試驗(yàn)利用同源重組的方法獲得玉米大斑病菌St3HNR和StLAC1基因敲除突變體，通過(guò)RNAi技術(shù)獲得StMR基因沉默轉(zhuǎn)化子，在此基礎(chǔ)上，對(duì)目的基因進(jìn)行功能研究，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.利用候選基因法克隆了玉米大斑病菌的1個(gè)1，3，8-三羥基萘還原酶基因，2個(gè)漆酶基因和1個(gè)調(diào)節(jié)基因，分別命名為St3HNR、StLAC1、StLAC2和StMR。獲得了St3HNR、StLAC1和StMR基因

3、的全長(zhǎng)cDNA和DNA序列，StLAC2基因的部分DNA序列。將St3HNR基因全序列及蛋白序列提交GenBank，獲得基因登錄號(hào)為No.EU681832，蛋白登錄號(hào)為No.ACD47140。
　　 2.對(duì)St3HNR、StLAC1和StMR基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。St3HNR基因DNA全長(zhǎng)918bp，cDNA為804bp，編碼267個(gè)氨基酸，分子量約為28.28kD，有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子；StLAC1基因DNA全長(zhǎng)1855bp

4、，cDNA為1806bp，編碼601個(gè)氨基酸，含有2個(gè)外顯子，1個(gè)內(nèi)含子：StMR基因DNA全長(zhǎng)3276bp，cDNA為3036bp，編碼1011個(gè)氨基酸，含有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子。試驗(yàn)中獲得的所有基因的內(nèi)含子均符合GT-AG法則。
　　 3.對(duì)玉米大斑病菌St3HNR基因的相似性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，St3HNR基因編碼產(chǎn)物與多種植物病原真菌的1，3，8-三羥基萘還原酶氨基酸序列具有95％以上的相似性，具有保守的還原酶結(jié)構(gòu)域，

5、但與玉米大斑病菌的1，3，6，8-四羥基萘還原酶(St4hnr)的相似性?xún)x為45.9％，說(shuō)明兩個(gè)基因?qū)儆诓煌倪€原酶類(lèi)群，在黑色素合成途徑中催化不同反應(yīng)。StLAC1基因編碼的氨基酸序列與多數(shù)真菌漆酶具有60％以上的相似性，StLAC2與Hortaea acidophila、Fusarium.proliferatum、Gaeumannomyces graminis等真菌漆酶基因具有33％～46％的相似性，但StLAC1和StLAC2間相

6、似性?xún)x為26.34％；StLAC1編碼的蛋白具有漆酶特有的3個(gè)Cu2+活性位點(diǎn)，即Cu-oxidise superfamily，并且活性區(qū)域高度保守。StMR基因編碼的蛋白與水稻胡麻斑病菌(Bipolaris oryzae)、玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)中調(diào)控黑色素合成的轉(zhuǎn)錄因子相似性為88％，該轉(zhuǎn)錄因子在N末端具有2個(gè)ZnF_C2H2結(jié)構(gòu)和一個(gè)類(lèi)似Zn(II)2Cys6的GAL4DNA結(jié)合域，

7、與水稻稻瘟病菌Pig1p、瓜類(lèi)炭疽病菌Cmr1p等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)相同，且相應(yīng)區(qū)域高度保守。
　　 4.Southern雜交結(jié)果表明，玉米大斑病菌的St3HNR和StLAC1基因在基因組中均以單拷貝形式存在，StLAC2基因以多拷貝形式存在。
　　 5.利用真核表達(dá)載體pPIC9K構(gòu)建了玉米大斑病菌St3HNR基因表達(dá)載體pPIC9K-St3HNR，采用電擊轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿豐菌GS115中并進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-

8、PAGE檢測(cè)結(jié)果表明St3hnr蛋白在宿豐菌中有分泌表達(dá)。
　　 6.利用質(zhì)粒pUCATPH和pBS，根據(jù)基因同源重組原理，構(gòu)建了St3HNR基因敞除載體。將重組DNA片段通過(guò)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌原生質(zhì)體，經(jīng)潮霉素篩選獲得了潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子，通過(guò)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因特異性引物及St3HNR基因特異性引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR篩選，得到了6個(gè)St3HNR基因缺失轉(zhuǎn)化子；以潮霉素基因和玉米大斑病菌St3HNR基因?yàn)樘结樂(lè)謩e進(jìn)行So

9、uthernblot驗(yàn)證，最終確定6個(gè)轉(zhuǎn)化子均為突變體，命名為△3hnr1、△3hnr2、△3hnr3、△3hnr4、△3hnr5和△3hnr6。對(duì)突變菌株進(jìn)行表型分析，結(jié)果顯示6株突變體菌落均成棕紅色，菌絲、分生孢子透明，菌絲和菌落形態(tài)無(wú)明顯變化，但生長(zhǎng)速度略小于野生型菌株：突變菌株產(chǎn)孢能力、HT-毒素產(chǎn)生能力、分生孢子萌發(fā)和附著胞形成能力均無(wú)明顯變化；但是突變菌株附著胞膨壓、附著胞穿透能力、健康寄主上的致病力顯著下降或喪失，突變菌株

10、在創(chuàng)傷寄主上的侵染能力沒(méi)有顯著變化，但是病斑擴(kuò)展面積較小。
　　 7.以ABTS為底物，采用分光光度計(jì)在420nm下測(cè)定漆酶活力，確定玉米大斑病菌細(xì)胞內(nèi)漆酶活力的影響因素。結(jié)果表明，酶活測(cè)定最佳反應(yīng)條件為0.6mmol/LABTS底物和Ph2.6的緩沖液，在反應(yīng)開(kāi)始后5min進(jìn)行測(cè)定：試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在250μmol/L，Cu2+濃度下培養(yǎng)的玉米大斑病菌漆酶活性最強(qiáng)。
　　 8.利用相同的基因敲除載體構(gòu)建策略構(gòu)建了StLAC

11、1基因敲除載體，潮霉素和PCR篩選后獲得轉(zhuǎn)化子StLAC1-M2、StLAC1-M3、StLAC1-M4。轉(zhuǎn)化子與野生型菌落顏色沒(méi)有明顯差別，但是檢測(cè)到StLAC1-M3和StLAC1-M4的胞外漆酶活性降低。
　　 9.利用PCR技術(shù)分兩步擴(kuò)增StMR基因片段，構(gòu)建了RNAi基因沉默載體，通過(guò)潮霉素篩選得到了不同沉默表型的轉(zhuǎn)化子。獲得的6個(gè)轉(zhuǎn)化子與野生型菌株相比，菌落顏色均發(fā)生了明顯變化，由灰黑色變成了黃白色，但是不同轉(zhuǎn)化子的

12、顏色有差異。轉(zhuǎn)化子R5、R7、R9和R8氣生菌絲低矮，菌絲密度高，菌落邊緣整齊。所有突變菌株均不產(chǎn)生分生孢子，菌絲透明，無(wú)黑色素沉積，菌絲形態(tài)不規(guī)整，多數(shù)彎曲并糾結(jié)在一起。
　　 由此得出結(jié)論：1)St3HNR基因在玉米大斑病菌黑色素合成、附著胞穿透力和致病力等方面具有重要功能；2)玉米大斑病菌中存在漆酶和至少2個(gè)漆酶的編碼基因，但StLAC1基因與玉米大斑病菌黑色素合成關(guān)系不明顯；3)StMR基因可以影響黑色素的合成，但具體調(diào)