玉米大斑病菌漆酶基因StLAC在黑色素合成中的功能分析.pdf

1、為研究玉米大斑病菌漆酶基因在黑色素合成及致病過(guò)程中的作用,本研究首次發(fā)現(xiàn)漆酶可以促進(jìn)玉米大斑病菌在寄主組織中的擴(kuò)展；利用同源重組的方法獲得了玉米大斑病菌漆酶基因StLAC1的敲除突變體；通過(guò)對(duì)突變體進(jìn)行分析,明確了StLAC1基因在黑色素合成中起著關(guān)鍵作用；利用PCR和RACE技術(shù)獲得了玉米大斑病菌漆酶基因StLAC2的全長(zhǎng)序列,同源性分析確定了StLAC2與StLAC1基因編碼氨基酸序列間的相似性為29.22％;主要研究結(jié)果如下:

2、r>　　 1.對(duì)玉米大斑病菌及9種常見(jiàn)植物病原真菌進(jìn)行漆酶活性比較,發(fā)現(xiàn)供試菌株均具有漆酶活性和降解木質(zhì)素的能力；漆酶活性測(cè)定結(jié)果表明,玉米大斑病菌的胞內(nèi)漆酶活性較高,為18.984 U·mL-1；致病力測(cè)定發(fā)現(xiàn),在玉米大斑病菌的致病過(guò)程中,漆酶可以促進(jìn)病原菌在寄主組織中的擴(kuò)展。
　　 2.利用基因敲除技術(shù),通過(guò)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的玉米大斑病菌漆酶基因StLAC1的敲除載體轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌野生型菌株原生質(zhì)體,經(jīng)潮霉素篩選

3、獲得了潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子,利用PCR、Southern blot及RT-PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,獲得了StLAC1基因的功能缺失突變體△StLAC1。
　　 3.對(duì)突變體△StLAC1進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn),△StLAC1菌落呈灰白色,黑色素合成受阻,菌絲透明且呈不規(guī)則狀,不產(chǎn)生分生孢子,生長(zhǎng)速率減慢,滲透調(diào)節(jié)能力增強(qiáng),附著胞膨壓、侵染能力顯著降低,漆酶活性有所降低。說(shuō)明StLAC1基因在玉米大斑病菌黑色素合成、附著胞穿透力和分生孢子形成等

4、方面具有重要作用。
　　 4.利用PCR和RACE技術(shù),獲得了玉米大斑病菌漆酶基因StLAC2的全長(zhǎng)序列。通過(guò)對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,確定了其DNA全長(zhǎng)1763 bp,含有3個(gè)外顯子,2個(gè)內(nèi)含子；cDNA為1665 bp,編碼554個(gè)氨基酸。同源性分析發(fā)現(xiàn),StLAC2基因編碼的氨基酸序列與許多其他真菌漆酶具有45％～76％的相似性,與已知StLAC1基因編碼的氨基酸序列間相似性僅為29.22％。聚類分析發(fā)現(xiàn),Stlac1和St