玉米大斑病菌StCHS5基因的結構及功能研究.pdf

1、本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌Fus3/Kss1MAPK級聯(lián)途徑下游的核心轉錄因子StSte12調控病菌附著胞發(fā)育及侵染過程，它直接結合于StCHS5的啟動子區(qū)域調控其表達。本研究利用生物信息學技術鑒定了大斑病菌中幾丁質合酶基因家族，并利用Real-time PCR技術分析了幾丁質合酶基因家族在病菌各個生長時期的表達模式。利用基因敲除技術獲得了StCHS5基因敲除突變體，通過對突變體的分析，明確了該基因部分生物學功能。主要研究結果如

2、下:
　　1.在大斑病菌基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出了幾丁質合酶基因家族并分析了其結構特征。該家族包含8個幾丁質合酶基因（StCHS1-StCHS8），基因組定位顯示該家族成員分散在病菌基因組中，其中StCHS4，StCHS5，StCHS2位于scaffold18上并串聯(lián)排列。這8個幾丁質合酶基因可分為7類，存在于3個亞家族中，其中StCHS6(classⅢ)，StCHS7(classⅠ)，StCHS8(classⅡ)屬于亞家族Ⅰ，包含催

3、化結構域Ⅰ和多次跨膜結構域;StCHS1(classⅣ)，StCHS2(classⅥ)，StCHS5(classⅤ)屬于亞家族Ⅱ，包含催化結構域Ⅱ和細胞色素b5結構域，其中幾丁質合酶第Ⅴ類和第Ⅵ類還包含肌動蛋白結構域;StCHS3和StCHS4屬于第Ⅶ類，且屬于亞家族Ⅲ，這類幾丁質合酶基因只包含跨膜結構域。
　　2.獲得了4株StCHS5基因敲除突變體。以pPZP100載體為基本骨架、潮霉素抗性基因(HPH)作為篩選標記，成功構建

4、了StCHS5基因敲除載體;利用農(nóng)桿菌介導的轉化技術，轉化大斑病菌野生型菌株01-23，通過潮霉素抗性篩選、特異引物PCR、RT-PCR驗證，獲得了4株StCHS5基因敲除突變體，分別命名為△StCHS5-1,△StCHS5-2,△StCHS5-3,△StCHS5-4。
　　3.研究發(fā)現(xiàn)StCHS5基因參與調控病菌的生長發(fā)育。與野生型菌株相比，突變體△StCHS5-1，△StCHS5-2，△StCHS5-3，△StCHS5-4的菌

5、落顏色形態(tài)、菌絲形態(tài)、分生孢子產(chǎn)量均發(fā)生顯著變化。突變體菌落顏色變淺，且產(chǎn)生較多的疏松的氣生菌絲;光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突變體菌絲細胞較野生型變長，但菌絲細胞直徑?jīng)]有明顯差異;進一步分析發(fā)現(xiàn)，突變體菌落生長速率增大，不產(chǎn)生分生孢子，黑色素含量顯著下降。
　　4.闡明了StCHS5基因參與調控大斑病菌細胞壁發(fā)育。①在CFW和剛果紅等細胞壁合成干擾物質的處理條件下，突變體菌落生長受抑制程度顯著低于野生型，表明StCHS5基因的缺失提高了

6、病菌對細胞壁合成干擾物質的耐受性。②通過掃描電鏡觀察突變體菌絲細胞壁的超微結構，結果發(fā)現(xiàn)，StCHS5基因的敲除突變體較野生型菌株細胞壁明顯變薄，細胞膜出現(xiàn)明顯的褶皺，胞吐現(xiàn)象明顯。③在細胞壁降解酶的作用下，StCHS5基因的敲除突變體產(chǎn)生的原生質體是野生型的2.81倍。④對突變體細胞壁中幾丁質含量分析發(fā)現(xiàn)，野生型菌株中幾丁質含量是StCHS5基因的敲除突變體中的21倍。以上結果表明，StCHS5基因不僅影響了病菌細胞壁的結構，也影響了

7、細胞壁的組分。
　　5.闡釋了StCHS5基因參與大斑病菌的附著胞發(fā)育及侵染過程，但對病菌的致病毒素的毒力沒有影響。①對突變體菌絲產(chǎn)生附著胞的情況分析發(fā)現(xiàn)StCHS5基因敲除突變體不能形成正常的附著胞和侵入釘結構。②玻璃紙穿透試驗進一步表明野生型菌絲可穿透玻璃紙，而突變體的菌絲不能穿透玻璃紙。③對病菌致病毒素的活性分析發(fā)現(xiàn)，其粗毒素活性與野生型的相比沒有明顯變化。④對致病性進行分析表明，StCHS5基因敲除突變菌株不能侵染健康的玉

8、米葉片，但能夠侵入并定殖在刺傷的寄主中。
　　6.明確了大斑病菌幾丁質合酶基因家族在野生型菌株及突變體中的表達模式。①利用Real-time PCR技術檢測了幾丁質合酶基因在病菌菌絲、分生孢子、芽管萌發(fā)、附著胞和侵入絲等時期的表達模式。結果顯示，StCHS1，StCHS3，StCHS4在菌絲時期相對表達水平最高，其次為附著胞時期，表達水平最低的為芽管萌發(fā)時期;StCHS6在菌絲時期相對表達水平最低，其他時期均顯著上升，且在芽管時期

9、最高;StCHS2，StCHS5，StCHS7，StCHS8均在附著胞時期相對表達水平最高，且相對菌絲時期，侵入絲時期StCHS2,StCHS5均顯著下降，StCHS7變化不大，StCHS8顯著上升。②分析了病菌中幾丁質合酶基因在StCHS5基因敲除突變體中的表達模式。結果表明，除了StCHS3基因，其余幾丁質合酶基因表達量均有所升高，其中StCHS1基因在StCHS5基因敲除突變體中表達量提高了1287.22倍，StCHS2提高了30