玉米大斑病菌PKC基因的功能研究.pdf

1、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是一種依賴磷脂和鈣的蛋白激酶，是Ca2+信號(hào)途徑中的成員。為了明確蛋白激酶C 與分生孢子萌發(fā)、附著胞形成及致病性之間的關(guān)系，本文利用PKC 特異性抑制劑—白屈菜赤堿（chelerythrine）研究了玉米大斑病菌分生孢子萌發(fā)、附著胞形成以及對(duì)玉米葉片表皮細(xì)胞的侵入等主要致病過(guò)程；利用Genome Walking 技術(shù)克隆了PKC基因5'端上游約1.5 kb的DNA序列，采用生物信息學(xué)

2、技術(shù)分析了該區(qū)域含有的主要元件，預(yù)測(cè)了該基因的功能；進(jìn)一步優(yōu)化了玉米大斑病菌原生質(zhì)體的制備條件，構(gòu)建了PKC基因同源重組載體和反義誘導(dǎo)表達(dá)載體，利用PEG介導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌原生質(zhì)體，獲得轉(zhuǎn)化菌株。
　　 利用PKC 特異性抑制劑—白屈菜赤堿（chelerythrine）的研究發(fā)現(xiàn)，在含有10 μmol/L抑制劑的PDA 培養(yǎng)基上，玉米大斑病菌菌絲的生長(zhǎng)受到了明顯抑制，菌落的顏色沒(méi)有變化，仍為灰黑色；抑制劑處理的分生孢子能正

3、常萌發(fā)，形成的附著胞顏色與形狀都沒(méi)有變化，但是附著胞不能直接穿透玉米葉片的表皮細(xì)胞，而是趨向于從氣孔侵入葉片內(nèi)部；抑制劑處理后的孢懸液接種玉米葉片3周后沒(méi)有呈現(xiàn)出病害癥狀。
　　 從含有10 μmol/L 抑制劑的PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的玉米大斑病菌菌絲中提取的HT-毒素在玉米葉片上仍顯示出較強(qiáng)的致病活性，表明白屈菜赤堿對(duì)玉米大斑病菌產(chǎn)生HT-毒素沒(méi)有明顯影響。
　　 基于pBS和pSO1質(zhì)粒分別構(gòu)建了玉米大斑病菌PKC基

4、因敲除載體和反義表達(dá)載體。
　　 利用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌原生質(zhì)體獲得27個(gè)基因敲除陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
　　 對(duì)繼代培養(yǎng)后的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得12個(gè)潮酶素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因插入的轉(zhuǎn)化菌株。轉(zhuǎn)化菌株的菌落平坦、菌絲纖細(xì)，產(chǎn)孢能力降低。
　　 獲得質(zhì)量高、數(shù)量多的原生質(zhì)體是遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵技術(shù)之一。在穩(wěn)滲劑較適宜的條件下，菌齡、酶種類(lèi)與濃度配比、酶解溫度及酶解時(shí)間是影響原生質(zhì)體形成的最重要的5個(gè)因素

5、，所以本文研究了這5個(gè)因素對(duì)玉米大斑病菌原生質(zhì)體制備的影響。結(jié)果表明，制備玉米大斑病菌原生質(zhì)體最佳條件為菌齡24 h，酶組合與酶濃度為1％溶壁酶+1％蝸牛酶+1％崩潰酶，酶解溫度30℃，酶解時(shí)間4 h。在此條件下，可以產(chǎn)生10個(gè)左右原生質(zhì)體（顯微鏡×400），約6×105個(gè)/mL。
　　 利用Genome Walking 技術(shù)獲得PKC基因5'端上游約1.5 kb的DNA序列。生物信息學(xué)分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類(lèi)似TATA 盒的元件，存在熱