調(diào)控玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病性的CaM基因的克隆與功能分析.pdf

1、玉米大斑病的控制始終是玉米生產(chǎn)上的一個(gè)重要問(wèn)題，而控制玉米大斑病危害的一個(gè)重要前提是要了解其致病過(guò)程。玉米大斑病菌的致病過(guò)程是玉米大斑病菌和寄主玉米相互識(shí)別、相互作用的過(guò)程，研究這一特異互作過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制對(duì)深入了解玉米大斑病菌的致病機(jī)理，設(shè)計(jì)新型殺菌劑，提出新的植物病害控制策略具有重要意義。本論文主要研究了Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)玉米大斑病菌分生孢子形態(tài)構(gòu)建及致病性的調(diào)控作用。 本文首先利用Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑特異性抑制劑確

2、定了Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與玉米大斑病菌的孢子萌發(fā)、附著胞形成和致病性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)素抑制劑TFP和鈣調(diào)磷酸酶抑制劑CsA處理分生孢子，隨著濃度的增加，對(duì)孢子萌發(fā)和附著胞形成過(guò)程的抑制作用明顯增強(qiáng)；同一濃度下，抑制劑對(duì)附著胞形成過(guò)程的抑制作用大于孢子萌發(fā)過(guò)程，抑制劑可使附著胞明顯變小甚至不能形成，以上結(jié)果表明鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與了玉米大斑病菌孢子萌發(fā)及疏水條件下附著胞形成過(guò)程的調(diào)控。 根據(jù)已知植物病原真菌鈣調(diào)素(CaM)氨基酸

3、序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以玉米大斑病菌cDNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)獲得CaM基因的同源片段，利用SMART-RACE技術(shù)獲得了CaM的cDNA全長(zhǎng)序列。并根據(jù)CaM基因cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)基因特異性引物擴(kuò)增玉米大斑病菌基因組DNA獲得了該基因DNA全長(zhǎng)。利用BLASTX軟件與GenBank中已知蛋白進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)該開放閱讀框所編碼的氨基酸序列與許多真菌如水稻胡麻斑(Cochliobolus miyabenus)、小麥穎枯病菌(

4、Phaeosphaeria nodorum)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)等的鈣調(diào)素基因的相似性為95％～100％。因此，初步推測(cè)該序列為玉米大斑病菌鈣調(diào)素基因CaM，所獲得的cDNA序列已提交GenBank(登錄號(hào)為EF010936)。玉米大斑病菌CaM基因DNA全長(zhǎng)776bp，cDNA全長(zhǎng)450bp，編碼149個(gè)氨基酸，有4個(gè)內(nèi)含子，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的所有內(nèi)含子均符合GT-AG法則。 利用genomic wal

5、king技術(shù)獲得CaM基因啟動(dòng)子序列，用Proscan在線軟件對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列含有多個(gè)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的保守序列(如TATA-box、Sp1、AP-2和TFIID)。Southern雜交結(jié)果表明，玉米大斑病菌的CaM基因在基因組中以單拷貝形式存在。 為了研究鈣調(diào)素基因?qū)Υ蟀卟【虏⌒缘恼{(diào)控作用，構(gòu)建了玉米大斑反義誘導(dǎo)表達(dá)載體，并對(duì)它們的正確性進(jìn)行了酶切驗(yàn)證。利用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將構(gòu)建好的含有潮霉素抗性篩選標(biāo)記的

6、反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到玉米大斑病菌原生質(zhì)體中，獲得了14個(gè)抗性轉(zhuǎn)化子，這些轉(zhuǎn)化子能在潮霉素抗性平皿上連續(xù)繼代培養(yǎng)。通過(guò)使用設(shè)計(jì)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移霉基因特異性引物和分子雜交進(jìn)行篩選，得到了2個(gè)CaM基因反義表達(dá)突變體。在奎寧酸誘導(dǎo)條件下，玉米大斑病菌CaM基因反義表達(dá)突變體分生孢子萌發(fā)率降低，分生孢子萌發(fā)后形成的附著胞多為畸形并且黑色素沉積減少，提取的HT-毒素對(duì)感病寄主葉片的毒力顯著下降。 利用候選基因法克隆了鈣調(diào)素下游的鈣調(diào)磷酸酶A

7、亞基、鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶基因。 鈣調(diào)磷酸酶A亞基編碼525個(gè)氨基酸，利用BLASTX軟件與GenBank中已知蛋白進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，所編碼的氨基酸序列與許多真菌如小麥穎枯病菌(P. nodorum)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)等的鈣調(diào)磷酸酶基因的相似性為86％～94％。因此，初步推測(cè)該序列為玉米大斑病菌鈣調(diào)磷酸酶基因CNA，所獲得的cDNA序列已提

8、交GenBank，序列登陸號(hào)為(EF407562)。該基因內(nèi)部含有6個(gè)內(nèi)含子，分別為116bp、47bp、47bp、47bp、47bp和49bp。 玉米大斑病菌中鈣調(diào)素依賴性的蛋白激酶有4個(gè)不同亞型，通過(guò)RACE技術(shù)已經(jīng)克隆出3個(gè)鈣調(diào)素依賴性的蛋白激酶基因的全長(zhǎng)，而第4個(gè)僅得到部分片段。所獲得的cDNA序列已提交GenBank，序列登陸號(hào)分別為(HJ605885，ELl605886，EU605887)。4個(gè)不同亞型的鈣調(diào)素依賴性