StH-PDE對玉米大斑病菌生長發(fā)育的影響及StPKA-C靶蛋白的篩選.pdf

1、玉米大斑病菌是一種重要的絲狀病原真菌，目前對病菌生物學(xué)、生理分化、遺傳變異、致病性、發(fā)育調(diào)控等研究較為深入。研究表明，由異源三聚體G蛋白介導(dǎo)的cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對植物病原真菌的生長發(fā)育及致病性有重要的調(diào)控作用。其中磷酸二酯酶通過調(diào)節(jié)細胞cAMP水平，既可以調(diào)控病菌的生長發(fā)育，同時又對病菌的細胞形態(tài)建成具有重要調(diào)控作用。本課題組已獲得2個編碼磷酸二酯酶基因StH-PDE和StL-PDE的缺失突變體，其中StH-PDE基因缺失突變體表現(xiàn)為

2、無分生孢子產(chǎn)生、細胞壁完整性缺陷及黑色素含量下降。為進一步證實StH-PDE基因在上述方面的作用，我們構(gòu)建了StH-PDE的回復(fù)載體，通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了StH-PDE回復(fù)突變體。該回復(fù)突變體的菌落形態(tài)、顏色，細胞壁完整性缺陷及黑色素含量均回復(fù)到WT菌株水平，但分生孢子產(chǎn)量遠未回復(fù)到WT菌株水平。
　　對StH-PDE敲除突變體及野生型菌株進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，尋找可能受到StH-PDE基因敲除影響并且與病菌絲狀生

3、長、細胞壁完整性等相關(guān)的功能基因。此外，蛋白激酶A作為cAMP下游的靶蛋白，通過磷酸化下游靶標蛋白發(fā)揮調(diào)控絲狀真菌的形態(tài)建成及致病性的作用。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)對蛋白激酶A催化亞基與候選蛋白的互作關(guān)系進行體內(nèi)驗證，并通過構(gòu)建原核表達載體對StPKA-C2進行原核表達及蛋白純化，為進一步體外獲得下游靶標蛋白奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　1.玉米大斑病菌StH-PDE基因調(diào)控分生孢子產(chǎn)生，但對病菌生長無明顯影響。
　　2.S

4、tH-PDE正調(diào)控大斑病菌黑色素生物合成。基因敲除使黑色素合成相關(guān)基因表達水平明顯下降，胞內(nèi)黑色素含量下降，菌落顏色明顯變淺。
　　3.StH-PDE正調(diào)控病菌細胞壁完整性?；蛉笔?dǎo)致8個幾丁質(zhì)合成酶基因中的7個基因表達明顯下調(diào)，細胞壁幾丁質(zhì)含量明顯降低。
　　4.對野生型(WT)、△StH-PDE菌株進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，△StH-PDE基因缺失突變體與WT相比，轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯變化，發(fā)現(xiàn)差異基因1620個，上調(diào)889個，