灰葡萄孢BcKMO基因?qū)Σ【L(zhǎng)發(fā)育和致病力的影響.pdf

1、通過(guò)篩選灰葡萄孢ATMT突變體庫(kù)，從中獲得了一株致病力增強(qiáng)的突變體BCG183，通過(guò)對(duì)該突變體的致病力和表型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該突變體致病力增強(qiáng)，在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)緩慢，不產(chǎn)生分生孢子和菌核，菌絲較野生型變細(xì)，明確了其突變基因?yàn)锽cKMO，為了進(jìn)一步證實(shí)該突變基因在灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)、分生孢子及菌核產(chǎn)生、致病過(guò)程中的作用，我們利用生物信息學(xué)方法，對(duì)突變基因及其編碼產(chǎn)物進(jìn)行了分析;利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，在BcKMO基因T-DN

2、A插入突變體(BCG183)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)制了該基因的回復(fù)突變體(BCG183/BcKMO)。對(duì)野生型、突變體BCG183和回復(fù)突變體BCG183/BcKMO的菌落、菌絲形態(tài)、生長(zhǎng)速度、分生孢子產(chǎn)量、致病能力和主要的致病因子（胞壁降解酶活性、毒素致病能力、致病相關(guān)基因表達(dá)水平等）進(jìn)行了比較研究，主要結(jié)果如下:
　　1.BcKMO，基因全長(zhǎng)1221 bp，無(wú)內(nèi)含子，編碼406個(gè)氨基酸的犬尿氨酸單氧酶(kynurenine3-monoo

3、xygenase，KMO)，含有單氧酶FAD的保守結(jié)構(gòu)域和4個(gè)類似芳香環(huán)羥化酶基序，具有NADPH氧化酶活性。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明BcKMO與核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）的gi563295659和從線嘴殼（Ophiostoma piceae）的gi512192943基因親緣關(guān)系較近。
　　2.突變體BCG183在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，不產(chǎn)生分生孢子和菌核，菌絲較野生型變細(xì)且致密;而野生型和回復(fù)突變體BC

4、G183/BcKMO生長(zhǎng)速度基本一致，均能產(chǎn)生分生孢子和菌核;突變體BCG183在蕓豆葉片和黃瓜葉片上的致病力明顯高于野生型和回復(fù)突變體。
　　3.突變體BCG183產(chǎn)生的多聚半乳糖醛酸酶(PG)、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性均較野生型和回復(fù)突變體（BCG183/BcKMO）明顯增強(qiáng)，但纖維素酶(Cx)、果膠甲基反式消除酶(PMGE)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)活性與野生型和回復(fù)突變體沒(méi)有明顯差別;突變體BCG183

5、的毒素活性較野生型和回復(fù)突變體明顯增強(qiáng);突變體BCG183的產(chǎn)酸能力較野生型和回復(fù)突變體（BCG183/BcKMO）明顯減弱;野生型、突變體BCG183和回復(fù)突變體BCG183/BcKMO均能穿透洋蔥表皮。
　　4.利用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)野生型、突變體BCG183、回復(fù)突變體BCG183/BcKMO中致病相關(guān)基因（bac、bcg2、bcg3、PkaR、bmp1、Sak1、bcreg1、bos1、bcp1、Ras2、