玉米大斑病菌cAMP依賴性蛋白激酶A基因的克隆與功能分析.pdf

1、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）是玉米上的一種重要絲狀病原真菌，引起的玉米大斑病（Northern Leaf Blight of Corn，簡(jiǎn)稱NCLB）是威脅玉米生產(chǎn)的一種重要的葉部病害。研究表明，cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在病菌的生長(zhǎng)發(fā)育和致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，蛋白激酶A是該途徑下游的主要效應(yīng)分子。本研究首先利用抑制劑試驗(yàn)初步確定了基因的功能，應(yīng)用候選基因法和Genome Walking技術(shù)克隆了玉米大斑病菌的c

2、AMP依賴性蛋白激酶A調(diào)節(jié)亞基基因（PKA-R）全長(zhǎng)序列和催化亞基基因（PKA-C）同源片段，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、基因缺失突變體分析等方面的研究，為進(jìn)一步明確cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在玉米大斑病菌致病過(guò)程中的作用提供了理論依據(jù)。
　　 本文利用PKA特異性抑制劑H89處理玉米大斑病菌孢懸液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分生孢子的萌發(fā)和附著胞的形成均受到抑制。H89隨著濃度的增加，對(duì)孢子萌發(fā)和附著胞形成的抑制作用明顯增強(qiáng)；同一濃度下，抑制劑對(duì)附著

3、胞形成過(guò)程的抑制作用大于孢子萌發(fā)過(guò)程。初步確定了PKA在病菌分生孢子萌發(fā)和附著胞的形成過(guò)程中起重要作用。
　　 根據(jù)已知植物病原真菌PKA-R和PKA-C基因的保守核苷酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物，以玉米大斑病菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增獲得了PKA-R和PKA-C基因的同源片段。利用Genome Walking技術(shù)對(duì)所得的基因片段進(jìn)行延伸，獲得了2688 bp的PKA-R基因全長(zhǎng)序列和1382 bp的PKA-C基因片段。Southern

4、雜交技術(shù)確定了PKA-R基因和PKA-C基因在玉米大斑病菌基因組中均以單拷貝形式存在。
　　 生物信息學(xué)分析表明，PKA-C基因編碼氨基酸序列與煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、小麥穎枯病菌（Phaeosphaeria nodorum）、小麥黃斑葉枯病菌（Pyrenophora tritici-repentis）等病原菌的PKA-C蛋白同源性達(dá)69％～85％；比對(duì)PKA-R基因DNA和cDNA序列發(fā)現(xiàn)，該

5、基因沒(méi)有內(nèi)含子，開(kāi)放閱讀框?yàn)?398 bp，編碼465個(gè)氨基酸殘基；蛋白的分子量約為50.437 kD，等電點(diǎn)pI5.68，編碼蛋白與小麥黃斑葉枯病菌（P.Tritici-repentis）、小麥穎枯病菌（P.Nodorum）、灰霉病菌（Botryotinia fuckeliana）等病原菌的PKA-R蛋白同源性達(dá)58％～88％。PKA-R蛋白為親水性細(xì)胞質(zhì)蛋白，沒(méi)有預(yù)測(cè)到信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，PKA-R蛋白由α-螺旋（3

6、4.84％）、β-折疊（13.55％）、β-轉(zhuǎn)角（4.52％）和隨機(jī)卷曲（47.10％）組成。
　　 為進(jìn)一步研究基因功能，試驗(yàn)構(gòu)建了PKA-R基因的雙交換同源重組型基因敲除載體及PKA-C基因的RNA干擾載體。對(duì)PKA-C基因的RNA干擾載體質(zhì)粒利用PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌的原生質(zhì)體，潮霉素篩選共獲得了11個(gè)轉(zhuǎn)化子。以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hph為探針，經(jīng)Southern雜交驗(yàn)證，確定了轉(zhuǎn)化子m5-1為突變體。對(duì)突變體m5-