蘋果周期蛋白依賴性蛋白激酶基因MdCDKB1的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、果實的重量和大小是農(nóng)業(yè)上很重要的兩種性狀，這種表型是由環(huán)境和基因共同作用的結(jié)果。蘋果的果實大小與品種的基因型有關(guān)，主要由果實細(xì)胞數(shù)目和大小決定。果實細(xì)胞數(shù)目是由蘋果果實發(fā)育早期的細(xì)胞分裂控制，控制細(xì)胞周期的相關(guān)基因調(diào)控果實的細(xì)胞數(shù)目，從而會影響最終的果實大小。研究果實發(fā)育過程中細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，對于研究調(diào)控果實大小相關(guān)的基因及這些基因表達(dá)的影響因素，以揭示果實大小的發(fā)育規(guī)律、影響因素及調(diào)控，具有重要的理論和實踐價值。本實驗以富士和

2、國光兩個蘋果品種為試材，從盛花后的心皮中克隆CDKB基因，并分別研究了花后不同發(fā)育階段的果實中和兩個品種的愈傷組織中CDKB基因的表達(dá)，主要結(jié)果如下：
　　 根據(jù)GenBank上植物的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶基因(CDKB)相關(guān)的序列，設(shè)計擴增引物，分別從國光和富士盛花期后的心皮中克隆得到了921bp的片段，分為兩種序列，其ORF均為915bp，編碼304個氨基酸。經(jīng)序列Blast，這兩種序列核苷序列和蛋白序列的最大一致性序列均為

3、植物的CDKB基因；其最大一致性EST序列分別是嘎啦蘋果中的兩個EST序列：CV085424(CDKB1；1)和EB138473(CDKB1；2)；生物信息學(xué)預(yù)測表明，其蛋白屬于植物CDKB家族的成員，其蛋白序列中有植物細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶B1(CDKB1)的基序PPTALRE。因此，把這兩個序列命名為MdCDKB1；1和MdCDKB1；2和MdCDKB1；1在富士蘋果和國光蘋果中的序列號分別為：JX041699和JX041701；M

4、dCDKB1；2在富士蘋果和國光蘋果中的序列號分別為JX041700、JX041702。
　　 在富士和國光果實發(fā)育的不同階段，兩品種中MdCDKB1；1基因的表達(dá)趨勢大體一致：富士和國光MdCDKB1；1基因表達(dá)量的高峰期都出現(xiàn)在花后21d，至花后4周期間其表達(dá)量較高，之后表達(dá)量呈下降趨勢；但在花后7d-35d期間，國光比富士高0.33到1倍，差異顯著；而在花后56d-77d時富士的表達(dá)量要比國光高出0.6到2倍。富士和國光M

5、dCDKB1；2基因表達(dá)趨勢大體一致：高峰期都出現(xiàn)在花后7d，但到花后35d之間表達(dá)量較高，之后呈下降趨勢，在7d-35d時國光要比富士的高0.16到1倍；富士在花后119d時表達(dá)量略有上升，出現(xiàn)小峰值，此時富士是國光的6倍，兩者差異顯著。
　　 以國光和富士蘋果的幼嫩葉片為外植體，經(jīng)培養(yǎng)獲得了大量優(yōu)質(zhì)的愈傷組織，把這些愈傷組織分別放在不同的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，研究MdCDKB1基因及其亞基基因MdCKS1基因的表達(dá)。結(jié)果表明：

6、
　　 (1)在MS培養(yǎng)基中分別添加NAA、6-BA及NAA+6-BA，與未添加激素的基本MS培養(yǎng)基(對照)相比，培養(yǎng)一周之后，愈傷組織中MdCDKB1；1和MdCDKB1；2和MdCKS1基因的表達(dá)發(fā)生明顯的變化：MdCDKB1；1和MdCDKB1；2和MdCKS1在基本MS培養(yǎng)基上的表達(dá)量最低，在添加激素的培養(yǎng)基上的表達(dá)量都顯著升高，MdCDKB1；1和MdCDKB1；2和MdCKS1的表達(dá)量分別提高0.8-2.5倍、1-4

7、倍和0.8-1倍。其中，以在MS+NAA+6-BA培養(yǎng)基上，三個基因的表達(dá)量都增加得最多；在MS斗NAA培養(yǎng)基上MdCDKB1；1和MdCDKB1；2的表達(dá)量比MS+6-BA培養(yǎng)基的略高，而MdCKS1表達(dá)量則在MS+NAA和MS+6-BA培養(yǎng)基差異不明顯。這表明，生長素或細(xì)胞分裂素都提高了愈傷組織中MdCDKB1；1和MdCDKB1；2和MdCKS1的表達(dá)量；并且當(dāng)二種激素同時存在時，MdCDKB1；1和MdCDKB1；2和MdCKS

8、1的表達(dá)量高于單獨的一種激素存在。
　　 (2)在相同的培養(yǎng)基上，國光和富士愈傷組織MdCDKB1；1的表達(dá)量差異不明顯，而CDKB1；2的表達(dá)量則是國光顯著高于富士。
　　 愈傷組織在低溫(10℃)下培養(yǎng)28d，抑制了MdCDKB1；1基因的表達(dá)；7d-14d的低溫培養(yǎng)之后再經(jīng)過常溫培養(yǎng)，可以恢復(fù)MdCDKB1；1基因的表達(dá)。低溫培養(yǎng)14d時抑制MdCDKB1；2基因表達(dá)的效果不明顯；低溫培養(yǎng)7d-28d再經(jīng)過常溫處理