豬帶絳蟲蛋白激酶A基因表達(dá)、活性分析及應(yīng)用研究.pdf

1、豬帶絳蟲（Taenia solium）是一種重要的人獸共患寄生蟲，其幼蟲不僅可以寄生于人的腦、眼、肌肉等處，引起相應(yīng)部位的囊尾蚴病，嚴(yán)重危害人類健康。cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)是cAMP信號(hào)通路中關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，PKA已成為治療癌癥、炎癥、寄生蟲病和其他免疫調(diào)控紊亂等復(fù)雜疾病的重要藥物靶點(diǎn)。此外，該酶的調(diào)節(jié)亞基具有種特異性，具有作為豬囊蟲病的特異性診斷抗原候選分子的潛力。鑒于此，本文對(duì)豬帶絳蟲cAMP依賴性蛋白激酶的調(diào)節(jié)亞基和

2、催化亞基分別進(jìn)行了研究，取得的結(jié)果如下:
　　1、利用豬帶絳蟲基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別設(shè)計(jì)豬帶絳蟲PKA調(diào)節(jié)亞基基因（Tspka-r）和催化亞基基因（Tspka-c）特異性引物，以豬囊尾蚴總RNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增Tspka-r和Tspka-c基因的完整ORF，并通過生物信息學(xué)分析并鑒定。結(jié)果表明，TsPKA-r和TsPKA-c均具有PKA的特征性結(jié)構(gòu)域。Tspka-r基因ORF大小為1104 bp，編碼367個(gè)氨基酸殘基

3、;Tspka-c基因ORF大小為1032 bp，編碼343個(gè)氨基酸殘基。
　　2、成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-Tspka-r，在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得以可溶性形式高效表達(dá)的重組蛋白TsPKA-r，大小約為55 kDa。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，TsPKA-r可以被豬囊尾蚴病陽性血清識(shí)別。以鎳珠瓊脂糖凝膠親和層析法純化的重組蛋白TsPKA-r為包被抗原，建立豬囊尾蚴病間接ELIS

4、A診斷方法。結(jié)果顯示，基于TsPKA-r的間接ELISA方法檢測(cè)豬囊尾蚴病的敏感性和特異性分別高達(dá)93.88％和96.40％，且與豬細(xì)頸囊尾蚴病、旋毛蟲病、豬弓形蟲病血清之間無交叉反應(yīng)。表明TsPKA-r有望作為豬囊蟲病診斷的候選抗原分子，從而解決現(xiàn)有血清學(xué)診斷方法存在交叉反應(yīng)的難題。
　　3、成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-Tspka-c，在畢赤酵母KM71中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Western blotting及質(zhì)譜測(cè)序鑒定重組

5、蛋白TsPKA-c成功表達(dá)，大小約為42 kDa。利用鎳珠瓊脂糖凝膠親和層析法純化的重組蛋白TsPKA-c免疫新西蘭大白兔，經(jīng)3次免疫后，獲得了高滴度的特異性IgG抗體。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TsPKA-c主要位于成蟲的體壁及生殖器官，推測(cè)豬帶絳蟲TsPKA-c可能與蟲體攝取營(yíng)養(yǎng)及生殖發(fā)育有關(guān)。
　　4、通過對(duì)酶動(dòng)力學(xué)分析得出TsPKA-c對(duì)底物Cretide的Km值為36.3679±2.64μM; Vmax為0.7648±0.0

6、13 nMol/min/μg。抑制動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，H89和PKI(14-22)對(duì)TsPKA-c具有明顯的抑制作用，其IC50分別為14.55±1.5μM、23.09±0.5μM。由此預(yù)示，H89和PKI(14-22)可以抑制TsPKA-c的活性，從而有望成為治療囊蟲病的新型藥物。
　　5、以體外培養(yǎng)的豆?fàn)钅椅豺蕿槟Ｐ?，用H89和PKI(14-22)分別處理蟲體后，觀察抑制劑對(duì)蟲體活力及蟲體葡萄糖吸收的影響。結(jié)果表明，H89和PKI