蠶豆葉片表皮鈣依賴蛋白激酶（CDPK）基因克隆和表達(dá)分析.pdf

1、該研究采用RT-PCR技術(shù)并結(jié)合RACE策略,成功地首次從蠶豆下表皮和葉片中克隆了編碼CDPK的全長(zhǎng)cDNA VfCPK1和cDNA片段VfCPK2,并對(duì)VfCPK1的表達(dá)特征進(jìn)行了初步研究.研究結(jié)果表明,用RT-PCR技術(shù),以CDPKs激酶區(qū)的保守氨基酸設(shè)計(jì)的一對(duì)簡(jiǎn)并引物,從蠶豆下表皮中擴(kuò)增到了3個(gè)141bp(141-1、141-2和141-3)的cDNA片段;用RACE技術(shù),以141-1序列設(shè)計(jì)的一對(duì)基因特異性引物,克隆到全長(zhǎng)cDN

2、A序列VfCPK1.用RT-PCR技術(shù),以CDPKs激酶區(qū)和連接區(qū)的保守氨基酸設(shè)計(jì)的一對(duì)簡(jiǎn)并引物,從蠶豆葉片中還擴(kuò)增到了3個(gè)618bp(618-1、618-2和618-3)的cDNA片段;用RACE技術(shù),以618-1序列設(shè)計(jì)的一對(duì)基因特異性引物,克隆到了還缺少5'末端的cDNA片段VfCPK2.VfCPK1的全長(zhǎng)為1785bp,其中編碼區(qū)為1482bp,可編碼493個(gè)AA,5'非編碼區(qū)為127bp,3'非編碼區(qū)為176bp,中間含有加尾

3、信號(hào)AATAAA,末尾是poly(A).由編碼區(qū)推測(cè)的VfCPK1的493個(gè)氨基酸序列具有已報(bào)道的CDPK的所有典型結(jié)構(gòu)特征,由N端到C端可分為可變區(qū)、激酶區(qū)、連接區(qū)和調(diào)節(jié)區(qū)四個(gè)結(jié)構(gòu)域.N端的可變區(qū)有26個(gè)氨基酸殘基,沒(méi)有豆蔻化所必需的保守序列MGXXC(S/Q)XXT,因此推測(cè)VfCPK1可能是水溶性蛋白.VfCPK1具有明顯的Ca<'2+>/鈣調(diào)素依賴蛋白激酶及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的激酶區(qū)以及類似于鈣調(diào)素的鈣結(jié)合區(qū).激酶區(qū)長(zhǎng)264

4、個(gè)氨基酸殘基,具有所有11個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域和15個(gè)對(duì)于真核生物絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶所必需的保守的氨基酸殘基.連接區(qū)有31個(gè)氨基酸殘基.C端的調(diào)節(jié)區(qū)有172個(gè)氨基酸殘基,有4個(gè)非常保守的EF手性鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域.推測(cè)的VfCPK1蛋白質(zhì)序列與植物中的許多CDPKs具有很高的同源性,包括大豆種子CDPKDa(同源性82﹪;29892113)、大豆SK5(CDPKα;同源性82﹪;116054)、大豆種子CDPKb(同源性80﹪;2989220

5、4)、馬鈴薯RiCDPK2(同源性79﹪;15289760)、大豆CDPKβ(同源性79﹪;2501764)、水稻CDPK(同源性78﹪;34147319)、玉米ZmCPK11(同源性78﹪;31747505)等.與擬南芥34個(gè)CDPKs相比,VfCPK1與AtCPK12、AtCPK4和AtCPK11的同源性最高,分別為77﹪、75﹪和74﹪.通過(guò)Northern和Western blot分析，我們研究了蠶豆鈣依賴蛋白激酶VfCPK1在

6、蠶豆不同部位包括根、莖、葉、葉肉和下表皮中的mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)情況以及不同外界脅迫處理對(duì)VfCPK1表達(dá)的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論是在mRNA還是蛋白質(zhì)水平上，VfCPK1都是在葉片中的表達(dá)量顯著高于根和莖中的表達(dá)量，尤其是在下表皮中的表達(dá)量最大，而在根和莖中的表達(dá)量低.因此，VfCPK1主要分布于蠶豆的葉片中，尤其在下表皮中.當(dāng)用不同濃度的PEG和不同的處理時(shí)間處理蠶豆葉片時(shí)，在mRNA和蛋白質(zhì)水平上，VfCPK1在葉片中的