蠶豆葉片表皮鈣依賴蛋白激酶（CDPK）基因克隆和表達分析.pdf

1、該研究采用RT-PCR技術并結合RACE策略,成功地首次從蠶豆下表皮和葉片中克隆了編碼CDPK的全長cDNA VfCPK1和cDNA片段VfCPK2,并對VfCPK1的表達特征進行了初步研究.研究結果表明,用RT-PCR技術,以CDPKs激酶區(qū)的保守氨基酸設計的一對簡并引物,從蠶豆下表皮中擴增到了3個141bp(141-1、141-2和141-3)的cDNA片段;用RACE技術,以141-1序列設計的一對基因特異性引物,克隆到全長cDN

2、A序列VfCPK1.用RT-PCR技術,以CDPKs激酶區(qū)和連接區(qū)的保守氨基酸設計的一對簡并引物,從蠶豆葉片中還擴增到了3個618bp(618-1、618-2和618-3)的cDNA片段;用RACE技術,以618-1序列設計的一對基因特異性引物,克隆到了還缺少5'末端的cDNA片段VfCPK2.VfCPK1的全長為1785bp,其中編碼區(qū)為1482bp,可編碼493個AA,5'非編碼區(qū)為127bp,3'非編碼區(qū)為176bp,中間含有加尾

3、信號AATAAA,末尾是poly(A).由編碼區(qū)推測的VfCPK1的493個氨基酸序列具有已報道的CDPK的所有典型結構特征,由N端到C端可分為可變區(qū)、激酶區(qū)、連接區(qū)和調節(jié)區(qū)四個結構域.N端的可變區(qū)有26個氨基酸殘基,沒有豆蔻化所必需的保守序列MGXXC(S/Q)XXT,因此推測VfCPK1可能是水溶性蛋白.VfCPK1具有明顯的Ca<'2+>/鈣調素依賴蛋白激酶及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的激酶區(qū)以及類似于鈣調素的鈣結合區(qū).激酶區(qū)長264

4、個氨基酸殘基,具有所有11個保守的亞結構域和15個對于真核生物絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶所必需的保守的氨基酸殘基.連接區(qū)有31個氨基酸殘基.C端的調節(jié)區(qū)有172個氨基酸殘基,有4個非常保守的EF手性鈣結合結構域.推測的VfCPK1蛋白質序列與植物中的許多CDPKs具有很高的同源性,包括大豆種子CDPKDa(同源性82﹪;29892113)、大豆SK5(CDPKα;同源性82﹪;116054)、大豆種子CDPKb(同源性80﹪;2989220

5、4)、馬鈴薯RiCDPK2(同源性79﹪;15289760)、大豆CDPKβ(同源性79﹪;2501764)、水稻CDPK(同源性78﹪;34147319)、玉米ZmCPK11(同源性78﹪;31747505)等.與擬南芥34個CDPKs相比,VfCPK1與AtCPK12、AtCPK4和AtCPK11的同源性最高,分別為77﹪、75﹪和74﹪.通過Northern和Western blot分析，我們研究了蠶豆鈣依賴蛋白激酶VfCPK1在

6、蠶豆不同部位包括根、莖、葉、葉肉和下表皮中的mRNA和蛋白質水平上的表達情況以及不同外界脅迫處理對VfCPK1表達的影響.實驗結果表明，無論是在mRNA還是蛋白質水平上，VfCPK1都是在葉片中的表達量顯著高于根和莖中的表達量，尤其是在下表皮中的表達量最大，而在根和莖中的表達量低.因此，VfCPK1主要分布于蠶豆的葉片中，尤其在下表皮中.當用不同濃度的PEG和不同的處理時間處理蠶豆葉片時，在mRNA和蛋白質水平上，VfCPK1在葉片中的