家蠶蛋白激酶C在BmPLV病毒感染的中腸組織中表達(dá)分析及家蠶蛋白激酶C抑制因子的原核表達(dá).pdf

1、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)存在于許多的信號(hào)通路當(dāng)中,在生物體內(nèi)參與許多生理生化過程,比如細(xì)胞生命周期中的生長,分化和凋亡,以及病毒的增殖等等。蛋白激酶C家族包括10個(gè)成員共由9個(gè)基因編碼。為了研究蛋白激酶C在家蠶細(xì)小病毒樣病毒(BmPLV)的增殖過程中所起的作用,本文從家蠶中腸中克隆到了一個(gè)非典型的蛋白激酶C,并且通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了原核表達(dá),以及對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行了純化,還制備了多克隆抗體,此外,還以感

2、染BmPLV病毒的感性品種和抗性品種的家蠶幼蟲中腸為實(shí)驗(yàn)材料,以蛋白質(zhì)印記法為手段檢測了家蠶蛋白激酶C在家蠶感染病毒時(shí)的表達(dá)。
　　 家蠶蛋白激酶C抑制因子在家蠶抗細(xì)小病毒樣病毒研究中的被發(fā)現(xiàn),蛋白激酶C抑制因子作為激酶抑制因子能特異的抑制蛋白激酶C作用的發(fā)揮。本研究對(duì)家蠶蛋白激酶C抑制因子進(jìn)行了克隆,并在原核表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)該基因做了表達(dá)分析。取得的研究結(jié)果如下:
　　 1.家蠶非典型蛋白激酶C的克隆和氨基酸序列特征

3、>　　 在家蠶中腸組織中克隆了非典型蛋白激酶C(BmaPKC)。BmaPKC編碼586個(gè)氨基酸。BmaPKC包括一個(gè)N末端調(diào)節(jié)區(qū)域和C末端激酶區(qū)域。利用生物信息學(xué)進(jìn)行了染色體定位,預(yù)測到BmaPKC基因定位在第3號(hào)染色體上。通過在線網(wǎng)站預(yù)測其細(xì)胞定位,可知其定位在細(xì)胞質(zhì)中。
　　 2.家蠶非典型蛋白激酶C原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　 將BmaPKC與表達(dá)載體pET-30a連接,重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-BmaPK

4、C轉(zhuǎn)化E.coli BL21,利用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。經(jīng)過對(duì)誘導(dǎo)條件的不斷優(yōu)化,30a-BmaPKC在21℃,加入0.8 mmol／LIPTG的情況下誘導(dǎo)得到的可溶性的帶有6個(gè)His標(biāo)簽融合蛋白的量最多。通過Western blot和質(zhì)譜鑒定顯示,所表達(dá)的蛋白為一個(gè)分子量大小為73KD的融合蛋白,這與我們預(yù)測的大小相同。此外用30a-BmaPKC融合蛋白免疫新西蘭大白兔,獲得了30a—BmaPKC的多克隆抗體。
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5、.在感染病毒的家蠶中腸組織中BmaPKC的表達(dá)時(shí)相
　　 通過Western blot檢測0,12,24,36,48,60,72小時(shí)感染了家蠶細(xì)小病毒樣病毒的中腸組織中BmaPKC的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的不斷推移非典型蛋白激酶C在家蠶感性品種中的表達(dá)量不斷提高,而在抗性品種中的表達(dá)量略低于感性品種,并且表達(dá)量變化也不明顯。由此推斷,BmaPKC在細(xì)小病毒類病毒增殖過程中可能發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。
　　 4.家蠶蛋白激酶C