三種人體帶絳蟲成蟲GST基因序列分析及牛帶絳蟲成蟲GST基因的克隆、表達和免疫學分析.pdf

1、目的：從豬帶絳蟲（Taenia solium）、牛帶絳蟲（Taenia saginata）和亞洲帶絳蟲（Taenia asiatica）成蟲 cDNA文庫中識別出谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）基因，生物信息學分析預(yù)測三者編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。對牛帶絳蟲成蟲GST(TasGST)進行克隆、表達和免疫學特性初步分析，為進一步研究三種人體帶絳蟲成蟲 GST在絳、囊蟲病診斷和疫苗的應(yīng)用價值提供

2、實驗依據(jù)。
　　方法：利用生物信息學方法從三種人體帶絳蟲成蟲 cDNA文庫中識別出 GST基因，利用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)（ExPASY，http://ca.expasy.org/）中有關(guān)基因和蛋白的序列和結(jié)構(gòu)信息分析的各種工具，結(jié)合其它生物信息學分析軟件包（如Pcgene和Vector NTI suite等）分析、預(yù)測

3、三者基因編碼蛋白質(zhì)的理化特性、翻譯后的修飾位點、功能域、亞細胞定位、拓撲結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三維空間構(gòu)象等，預(yù)測三者編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。將TasGST克隆到原核表達質(zhì)粒 pET-28a(+)中，在大腸埃希菌 BL21/DE3中用IPTG誘導(dǎo)表達,表達產(chǎn)物行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),用鎳離子金屬螯合劑親和層析柱進行純化,純化蛋白免疫 SD大鼠制備免疫血清，用Western Blot ting方法分析重組蛋白的免

4、疫原性和免疫反應(yīng)性。
　　結(jié)果：三者序列都包含完整開放閱讀框，為 GST的全長基因，推導(dǎo)出的氨基酸序列與GenBank中其它絳蟲GST氨基酸序列的一致性均超過85％。三者編碼的蛋白在氨基酸數(shù)目、蛋白理化性質(zhì)、活性位點的B細胞線性表位、亞細胞定位等方面存在一定差異。將預(yù)測的線性表位標注在三種人體帶絳蟲成蟲 GST三維結(jié)構(gòu)的表面，結(jié)果顯示三種帶絳蟲的主要線性表位在空間結(jié)構(gòu)上處于相距較遠的分子表面。三種人體帶絳蟲成蟲與其它物種 GST氨

5、基酸序列構(gòu)建進化樹結(jié)果顯示，三者的親緣關(guān)系接近。對TasGST基因進行克隆、表達，雙酶切及測序結(jié)果均表明重組質(zhì)粒pET-28a(+)-TasGST構(gòu)建成功。SDS-PAGE結(jié)果表明目的基因在大腸桿菌BL-21/DE3中獲得可溶性表達，經(jīng)親和層析獲得了純化蛋白。TasGST重組蛋白可被其免疫的SD大鼠血清識別，具有免疫原性；TasGST重組蛋白可被感染囊尾蚴的牛血清和牛帶絳蟲患者血清識別，具免疫反應(yīng)性。
　　結(jié)論：利用生物信息學對三