多頭帶絳蟲轉錄組學分析及TmPKA--C基因的克隆與原核表達.pdf

1、腦多頭蚴病(Cerebral coenurosis)是一種羊等動物的致死性中樞神經系統(tǒng)寄生蟲病，由多頭帶絳蟲（Taenia multiceps）的中絳期幼蟲——腦多頭蚴（Coenurus cerebralis）所引起。人也可以作為中間宿主被感染。多頭帶絳蟲的生活史包括成蟲、腦多頭蚴（囊液、原頭節(jié)和囊壁）、六鉤蚴三個時期。為了與寄生生活相適應，多頭帶絳蟲在不同發(fā)育階段所表達的基因有所不同，研究其期特異性表達基因，對于進一步了解多頭帶絳蟲蟲

2、體的發(fā)育機理及寄生生活具有重大意義。
　　本研究利用RNA-seq轉錄組測序技術對多頭帶絳蟲的六鉤蚴、原頭節(jié)、囊壁、成蟲以及成蟲的頭頸節(jié)、未成熟-成熟節(jié)片和孕節(jié)共7個轉錄組樣品進行了分析，共鑒定出12822個基因(FPKM＞0)。分析了六鉤蚴、原頭節(jié)、囊壁和成蟲之間以及成蟲的頭頸節(jié)、未成熟-成熟節(jié)片和孕節(jié)之間的差異表達基因(DEGs)，其中成蟲時期上調表達的基因數量高于其他時期，未成熟-成熟節(jié)片上調表達的基因數量高于頭頸節(jié)和孕節(jié)，

3、并且發(fā)現了大量與蟲體發(fā)育和宿主相互作用相關的基因。通過進一步分析，在不同發(fā)育時期共鑒定到2437個期特異性上調表達基因，在成蟲的不同組織部位共鑒定到1228個組織特異上調表達基因。GO分析發(fā)現，期特異性和組織特異性上調表達基因主要聚類到細胞過程和代謝過程、結合和催化活性以及細胞和細胞組分。KEGG分析發(fā)現這些特異性上調表達基因主要參與代謝、遺傳信息處理、細胞過程和環(huán)境信息處理等過程。qRT-PCR實驗結果表明，差異表達基因的mRNA轉錄

4、水平與轉錄組學分析結果基本一致，說明運用RNA-seq測序技術鑒定的差異表達基因具有很高的可信度。
　　根據轉錄組分析結果，篩選出蛋白激酶A催化亞基基因家族為進一步研究對象。該基因家族包含4個蛋白激酶A催化亞基基因，分別命名為TmKA-C1、TmPKA-C2、TmPKA-C3和TmPKA-C4。根據4個TmPKA-C基因的開放閱讀框(ORF)設計特異性引物，以成蟲總RNA為模板，RT-PCR擴增獲得了4個TmPKA-C基因的完整O

5、RF。序列分析結果表明，這4個TmPKA-C基因均具有典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點、蛋白激酶ATP結合位點以及蛋白激酶結構域。綜合生物信息學分析結果，選取TmPKA-C1和TmPKA-C2蛋白研究其反應原性。將TmPKA-C1和TmPKA-C2基因連接到pET30a原核表達載體，構建重組表達質粒，轉入大腸桿菌感受態(tài)Transetta(DE3)后誘導表達。SDS-PAGE分析結果顯示，重組蛋白TmPKA-C1和TmPKA-C2在原