多頭帶絳蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及TmPKA--C基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、腦多頭蚴病(Cerebral coenurosis)是一種羊等動(dòng)物的致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)寄生蟲(chóng)病，由多頭帶絳蟲(chóng)（Taenia multiceps）的中絳期幼蟲(chóng)——腦多頭蚴（Coenurus cerebralis）所引起。人也可以作為中間宿主被感染。多頭帶絳蟲(chóng)的生活史包括成蟲(chóng)、腦多頭蚴（囊液、原頭節(jié)和囊壁）、六鉤蚴三個(gè)時(shí)期。為了與寄生生活相適應(yīng)，多頭帶絳蟲(chóng)在不同發(fā)育階段所表達(dá)的基因有所不同，研究其期特異性表達(dá)基因，對(duì)于進(jìn)一步了解多頭帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)

2、體的發(fā)育機(jī)理及寄生生活具有重大意義。
　　本研究利用RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)多頭帶絳蟲(chóng)的六鉤蚴、原頭節(jié)、囊壁、成蟲(chóng)以及成蟲(chóng)的頭頸節(jié)、未成熟-成熟節(jié)片和孕節(jié)共7個(gè)轉(zhuǎn)錄組樣品進(jìn)行了分析，共鑒定出12822個(gè)基因(FPKM＞0)。分析了六鉤蚴、原頭節(jié)、囊壁和成蟲(chóng)之間以及成蟲(chóng)的頭頸節(jié)、未成熟-成熟節(jié)片和孕節(jié)之間的差異表達(dá)基因(DEGs)，其中成蟲(chóng)時(shí)期上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)量高于其他時(shí)期，未成熟-成熟節(jié)片上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)量高于頭頸節(jié)和孕節(jié)，

3、并且發(fā)現(xiàn)了大量與蟲(chóng)體發(fā)育和宿主相互作用相關(guān)的基因。通過(guò)進(jìn)一步分析，在不同發(fā)育時(shí)期共鑒定到2437個(gè)期特異性上調(diào)表達(dá)基因，在成蟲(chóng)的不同組織部位共鑒定到1228個(gè)組織特異上調(diào)表達(dá)基因。GO分析發(fā)現(xiàn)，期特異性和組織特異性上調(diào)表達(dá)基因主要聚類到細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程、結(jié)合和催化活性以及細(xì)胞和細(xì)胞組分。KEGG分析發(fā)現(xiàn)這些特異性上調(diào)表達(dá)基因主要參與代謝、遺傳信息處理、細(xì)胞過(guò)程和環(huán)境信息處理等過(guò)程。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，差異表達(dá)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄

4、水平與轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果基本一致，說(shuō)明運(yùn)用RNA-seq測(cè)序技術(shù)鑒定的差異表達(dá)基因具有很高的可信度。
　　根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，篩選出蛋白激酶A催化亞基基因家族為進(jìn)一步研究對(duì)象。該基因家族包含4個(gè)蛋白激酶A催化亞基基因，分別命名為TmKA-C1、TmPKA-C2、TmPKA-C3和TmPKA-C4。根據(jù)4個(gè)TmPKA-C基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)設(shè)計(jì)特異性引物，以成蟲(chóng)總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增獲得了4個(gè)TmPKA-C基因的完整O

5、RF。序列分析結(jié)果表明，這4個(gè)TmPKA-C基因均具有典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)、蛋白激酶ATP結(jié)合位點(diǎn)以及蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。綜合生物信息學(xué)分析結(jié)果，選取TmPKA-C1和TmPKA-C2蛋白研究其反應(yīng)原性。將TmPKA-C1和TmPKA-C2基因連接到pET30a原核表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)Transetta(DE3)后誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，重組蛋白TmPKA-C1和TmPKA-C2在原