犬瘟熱病毒核蛋白基因的克隆與原核及真核表達(dá).pdf

1、犬瘟熱是嚴(yán)重威脅中國養(yǎng)犬業(yè)發(fā)展的主要傳染病之一,免疫接種是預(yù)防此病的重要措施;為克服常規(guī)疫苗的不足,我們構(gòu)建了犬瘟熱核蛋白(N)基因的重組質(zhì)粒,這為研制新一代安全高效、使用方便的核酸疫苗打下基礎(chǔ).以犬瘟熱病毒OP株感染Vero細(xì)胞收獲病毒提取的RNA為模板,根據(jù)已發(fā)表的犬瘟熱病毒OP株序列設(shè)計(jì)兩對引物,RT-PCR擴(kuò)增出N基因的822bp、897bp片段.將PCR產(chǎn)物按正確的閱讀框架定向克隆進(jìn)pGEX-6p-1載體中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶

2、(GST)基因的下游,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌BL<,21>中,在此7℃ 1.0mM IPIG的誘導(dǎo)下,核蛋白基因分段獲得了良好的表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定,確定其表達(dá)融合蛋白質(zhì)的大小分別52kDa、54kDa.將表達(dá)產(chǎn)物回收后混合免疫小鼠,間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)顯示免疫小鼠的血清能與病毒感染的細(xì)胞呈現(xiàn)特異反應(yīng),表明體外表達(dá)核蛋白基因保留了天然蛋白部分的抗原性.設(shè)計(jì)含EcoR Ⅰ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的一對引物,采用RT-