南極冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)與谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase,GST)是谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)中的重要酶類,能夠清除體內(nèi)H2O2和許多有機(jī)氫過氧化物,并且具有解毒功能。S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl—L-homocysteine hydrolase,SAHH)是一種細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的酶,在調(diào)節(jié)生物體轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)中占據(jù)重要地位。本實(shí)驗(yàn)通過RT-

2、PCR及RACE-PCR技術(shù)成功克隆了南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L GPx、GST和SAHH基因全長,分別命名為ICE-LGPx、ICE-LGST和ICE-LSAHH,并對(duì)其做了全面的生物信息學(xué)分析。還研究了ICE-LGPx和ICE-LGST基因在不同鹽度和CdCl2作用前后的表達(dá)變化并構(gòu)建了ICE-LGPx和ICE—LGST基因的原核表達(dá)載體。
　　 ICE-LGPx基因全長1956 bp,編碼255個(gè)

3、氨基酸。預(yù)測(cè)分子量為28.3 KD,理論等電點(diǎn)為9.07。ICE-LGPx基因在進(jìn)化上與綠藻類如Micromonas sp.RCC299和Micromonas pusilla親緣關(guān)系較為相近。在序列3’非編碼區(qū)末端有-102 bp的SECIS(硒代半胱氨酸插入序列)元件。ICE-LGPx基因的三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果顯示該蛋白含有5個(gè)α螺旋和7個(gè)β折疊；ICE-LGST基因的全長966 bp,編碼321個(gè)氨基酸。推導(dǎo)其分子量為24.1 KD,理

4、論等電點(diǎn)為9.69。ICE-LGST基因與萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)線粒體GST同源性最高,蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果同樣顯示ICE-LGST基因可能來源于線粒體。三維結(jié)構(gòu)顯示ICE-LGST亞基共有9個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊,并且具有兩個(gè)基本功能域:GSH結(jié)合位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)；ICE-LSAHH全長1844 bp,編碼487個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的分子量為53 KD,等電點(diǎn)為5.16。氨基酸的同源比對(duì)分析表

5、明SAHH是一個(gè)進(jìn)化上比較保守的蛋白,與其他物種SAHH基因具有較高的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示ICE-LSAHH與杜氏鹽藻(Dunaliella salina)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小球藻(Chlorellavariabilis)等有較近親緣關(guān)系。三維結(jié)構(gòu)顯示其亞基共有20個(gè)α-螺旋和12個(gè)β-折疊,并且由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:大的N端底物結(jié)合域、NAD結(jié)合域和C端域。
　　 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光

6、定量PCR技術(shù)(Real-time PCR),以ICE-Lβ-actin和ICE-L GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參照,研究了ICE-LGPx和ICE-LGST基因在不同鹽度和不同濃度CdCl2(μmol·L-1)作用前后的表達(dá)變化。結(jié)果表明,在不同NaCl濃度脅迫作用下ICE-LGPx和ICE-LGST基因均有表達(dá),且呈先上升后下降的趨勢(shì)。ICE-LGPx在鹽度11和66時(shí),24 h達(dá)到表達(dá)量最大值；在鹽度22和99時(shí),12 h達(dá)到表達(dá)量最大值

7、。ICE—LGST在低鹽度11和22時(shí),24 h達(dá)到最大表達(dá)量,在高鹽度99時(shí)12 h表達(dá)量最大。ICE-LGST基因?qū)χ亟饘冁k的響應(yīng)高于ICE—LGPx。ICE-LGPx基因在CdCl2濃度為10和20μmol·L-1時(shí),表達(dá)量最大值分別出現(xiàn)在48 h和24 h；CdCl2濃度為30和40μmol·L-1時(shí)在12 h時(shí)即達(dá)到最大值。ICE—LGST基因在CdCl2濃度為10和20μmol·L-1時(shí),表達(dá)量最大值分別出現(xiàn)在36 h和48