鹽藻DsSTPK基因的載體構(gòu)建、原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位分析.pdf

1、鹽生杜氏藻(Dunaliella salina,以下簡(jiǎn)稱鹽藻)是公認(rèn)的能夠耐受高鹽的低等真核生物,是研究植物高鹽適應(yīng)的模式生物。多年以來(lái),許多學(xué)者從鹽藻適應(yīng)高鹽環(huán)境的滲透調(diào)節(jié)、耐鹽相關(guān)基因的克隆及質(zhì)膜、胞漿蛋白質(zhì)等方面進(jìn)行了研究,取得了一定的進(jìn)展。但到目前為止,對(duì)其耐鹽的分子機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑仍不清楚。細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種外界刺激的主要調(diào)節(jié)機(jī)制是對(duì)通路蛋白的磷酸化。蛋白激酶通過(guò)對(duì)底物蛋白的磷酸化參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用的

2、信號(hào)分子。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase,STPK)是其中最重要的一類蛋白激酶,可催化多種功能蛋白(如酶、受體、運(yùn)輸?shù)鞍?、調(diào)節(jié)蛋白、核內(nèi)蛋白等)的磷酸化,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生命活動(dòng)過(guò)程。因此,絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的研究對(duì)于闡明鹽藻復(fù)雜的耐鹽機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。
　　本研究構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGS-21a-DsSTPK,真核表達(dá)載體pMDCSGN和pBI121-DsSTPK

3、,對(duì)已經(jīng)獲得的鹽藻絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因進(jìn)行了原核表達(dá)和亞細(xì)胞定位的分析,為進(jìn)一步研究STPK在鹽藻耐鹽過(guò)程中的作用及分子機(jī)制提供了新的信息。主要的實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下:
　　1.應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增了鹽藻DsSTPK基因,并將其克隆到pMDTM18-T Simple Vector上。DNA測(cè)序結(jié)果表明,該核苷酸序列未發(fā)生突變。利用限制性內(nèi)切酶分別酶切克隆載體與表達(dá)載體,T4 DNA連接酶連接目的片段與載體大片段,成功構(gòu)建了原核表

4、達(dá)載體pGS-21a-DsSTPK,真核表達(dá)載體pMDCSGN和pBI121-DsSTPK,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證讀碼框正確。
　　2.將原核表達(dá)載體 pGS-21a-DsSTPK導(dǎo)入E.coli.BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在E.coli BL21中得到成功表達(dá)。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè),融合蛋白在上清和包涵體中均有存在。將上清蛋白經(jīng)過(guò)GST標(biāo)簽蛋白純化柱純化后獲得了純度較高的可溶性融合蛋白, Western blot顯示該融合蛋白