家蠶一新基因Bmpseg的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位.pdf

1、在對(duì)自建的家蠶蛹期cDNA文庫(kù)測(cè)序中，我們篩選到一條cDNA序列，GenBank登錄號(hào)DY231426，通過(guò)生物信息學(xué)分析，該基因同源性很低，而且也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)保守結(jié)構(gòu)域。該基因長(zhǎng)度為66.bp，其中5'UTR長(zhǎng)9.bp，3'UIR長(zhǎng)7.bp，ORF長(zhǎng)48.bp，編碼161個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為18.6.kD，理論等電點(diǎn)為9.461。Unigene分析預(yù)測(cè)該基因只在蛹期表達(dá)，因此，將其命名為pupa-sepecificexpressti

2、o.gene(Bmpseg)。利用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測(cè)該基因的蛋白存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽。
　　 通過(guò)PCR把Bmpseg的ORF擴(kuò)增后插入到載體PGEX-4T-3的BamHI和Xh.I位點(diǎn)，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-Bmpseg，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測(cè)序分析證實(shí)重組正確。IPTG誘導(dǎo)后裂解菌作SDS-PAGE分析，在44 kD處有一濃集特異性蛋白條帶，與預(yù)期值相符。融合蛋白以不溶性的包涵體

3、的形式存在，超聲波裂解菌體分離包涵體并離心、洗滌；對(duì)包涵體進(jìn)行溶解和梯度透析復(fù)性；采用親和層析法純化融合蛋白Bmpseg。以該融合蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔，制備了Bmpseg多克隆抗體，經(jīng)Protei HP凝膠柱純化后，ELISA檢測(cè)該抗體的效價(jià)可達(dá)到1:12800。免疫印跡檢測(cè)顯示該抗體對(duì)Bmpseg有特異性識(shí)別能力。提取五齡蠶脂肪體、馬氏管、氣管、睪丸、腸、頭、絲腺、表皮等不同組織總蛋白和不同發(fā)育時(shí)期總蛋白，做免疫印跡試驗(yàn)，結(jié)果表