鴨瘟強毒dUTPase基因的原核表達及在病毒感染宿主亞細(xì)胞定位研究.pdf

1、此文對本研究小組發(fā)現(xiàn)的DPVdUTPase基因(GenBank登錄號DQ486149)開展了以下系列研究：DPVdUTPase基因序列特征密碼子偏愛性分析、克隆、原核表達和抗體制備、在病毒感染宿主鴨胚成纖維細(xì)胞中的表達產(chǎn)物亞細(xì)胞定位檢測、轉(zhuǎn)錄和表達時相分析、基于dUTPase蛋白的間接免疫熒光和間接免疫組化檢測石蠟切片中DPV方法的建立以及dUTPase在DPV強毒人工感染鴨組織中表達的動態(tài)定位監(jiān)測等，結(jié)果如下： 1.鴨瘟病毒d

2、UTPase基因序列特征及密碼子偏愛性分析 DPVdUTPase基因大小為1344bp，編碼477aa，包含dUTPase家族蛋白的5個保守motifs(motiflPKRTEDAAYDI、motif2GRSS、Motif3GLIDSGYRG、motif4GDRIAQ、motif5RQFSGFGS)，排列形式3-1-2-4-5具備Ⅱ型dUTPase的典型特征。DPVdUTPase基因在33個皰疹病毒參考株間高度保守，與禽皰疹病毒

3、首先類聚，并與α皰疹病毒的氨基酸同源性較之與β、γ皰疹病毒要高。DPVdUTPase多肽鏈由61種密碼子編碼而成，密碼子的第三位偏愛于堿基A和T。DPVdUTPase基因與大腸桿菌、酵母及人的密碼子使用頻率比較，差值較大的大腸桿菌有19個，酵母有16個，人有15個。方差分析顯示DPVdUTPase基因密碼子與酵母差異極顯著(r=0.536，P＜0.01)。 2.dUTPase基因的克隆、原核表達及多克隆抗體的制備 通過構(gòu)

4、建pET-32-DUT重組原核表達載體，利用IPTG進行誘導(dǎo)表達，得到大小約為66kD的重組融合蛋白，與預(yù)期表達的蛋白大小相一致。薄層掃描分析表明重組蛋白占菌體總蛋白的36.2％，主要以包涵體的形式存在。最佳表達優(yōu)化條件為0.8mmol/L的IPTG，30℃下誘導(dǎo)4～5h。利用純化的重組蛋白制備兔抗高免血清，間接ELISA效價為1:204800。兔抗dUTPaseIgG經(jīng)辛酸一硫酸銨鹽析和High-Q陰離子交換層析純化具高效、特異性強的

5、優(yōu)點。 3.DPV體外感染宿主細(xì)胞dUTPase基因轉(zhuǎn)錄及表達時相分析 RNADot-blot分析表明，最早可在感染后30min檢測到該基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，隨后轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量迅速放大，4h達高峰，一直持續(xù)到了感染后72h。這種轉(zhuǎn)錄譜具有皰疹病毒早期基因的典型特征。以制備的兔抗dUTPaseIgG為一抗，對感染鴨瘟強毒的DEF進行Westernblot分析，感染后8～72h可檢測到觀察到與預(yù)測大小(約49kD)相一致的單一條帶，以感

6、染后12～24h反應(yīng)條帶濃度最大，并一直持續(xù)到感染后期。綜合分析DPVdUTPase基因的轉(zhuǎn)錄表達時相模式，推測該基因為病毒的早期基因，dUTPase的出現(xiàn)及其表達時相可能對晚期蛋白如衣殼蛋白、囊膜糖蛋白等的表達起激活作用，并與病毒的生長周期密切相關(guān)。 4.DPVdUTPase基因產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中的表達與亞細(xì)胞定位 通過細(xì)胞免疫熒光進行病毒感染DEF的亞細(xì)胞定位檢測，結(jié)果表明特異性熒光可最早在感染后4h的胞質(zhì)中檢測到，1

7、2h大量點狀綠色熒光聚集于胞核；24h后胞核內(nèi)點狀熒光減弱而胞質(zhì)點狀熒光增強：48h胞核和胞質(zhì)熒光均顯著減弱。這種分布特征變化可初步推測為DPV基因組編碼的dUTPase在細(xì)胞質(zhì)中完成蛋白質(zhì)的合成，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核發(fā)揮其基本生物學(xué)功能，催化水解脫氧尿苷三磷酸(dUTP)和為DNA的合成提供必需的原料(dTTP)，維持高的dTTP/dUTP比率，阻止尿嘧啶插入到病毒DNA，在DNA合成的高保真度上起監(jiān)視作用。 5.DPVdUTPa

8、se在人工感染鴨組織的定位分析 用鴨瘟強毒感染成年鴨復(fù)制鴨瘟急性病例，分別于接種后不同時間，取心、肝、脾、腎、胸腺、腸道、法氏囊、腦等組織制作石蠟切片，進行間接免疫熒光和間接免疫組化檢測DPVdUTPase在人工感染鴨組織的定位。結(jié)果表明：心、肝、脾、胰、肺、。腎、法氏囊、腦、胸腺、十二指腸、空腸、回腸、直腸、盲腸扁桃體、哈德氏腺免疫熒光呈陽性或強陽性，氣管、肌肉、皮膚呈陰性。最早可在感染后2h檢測到少量DPVdUTPase抗原

9、位于大腦、盲腸扁桃體、法氏囊；12h后組織器官中的DPVdUTPase陽性檢出率達50％以上，并在感染后4d達最高峰。病毒編碼dUTPase主要位于腦神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、免疫器官淋巴巨噬細(xì)胞等末端分化細(xì)胞中?？梢姡珼PV人工感染鴨后，首先對神經(jīng)系統(tǒng)和免疫器官進行攻擊，然后進一步侵害全身各器官組織。病毒在感染早期大量編碼自身dUTPase，可能在一定程度上彌補了感染中后期因組織破壞及細(xì)胞功能喪失導(dǎo)致的(dUTPase不足，為保證病毒DNA復(fù)