鴨腸炎病毒gD蛋白亞細胞定位及其對病毒感染相關作用的研究.pdf

1、鴨病毒性腸炎(duck viral enteritis，DVE)，又名鴨瘟(duck plague，DP)，是鴨、鵝等多種雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。本病病原為鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)，屬于皰疹病毒科，尚未定亞科及屬。皰疹病毒糖蛋白D(Glycoprotein D，gD)為病毒主要毒力蛋白，對病毒的侵入和病毒包膜及細胞膜的融合有一定的促進作用。gD蛋白參與病毒的免疫逃避機制，與胞質(zhì)中的

2、TAP結(jié)合，阻斷MHC I類分子的抗原呈遞途徑。針對gD蛋白的功能研究對進一步了解病毒感染機理有重要理論意義。
　　 本研究以鴨腸炎病毒(DEV)C-KCE株的基因組為模板，PCR擴增得到us60RF，并對其進行了詳盡的生物信息學分析，包括氨基酸同源性、編碼蛋白結(jié)構等。利用原核表達系統(tǒng)pET30a(+)(E.coli Rosetta)，獲得大小約為47KDa的重組gD基因胞外區(qū)(gDw)蛋白。免疫家兔制備兔抗gDw蛋白高免血清，

3、血清瓊擴效價為1:16，中和抗體效價為1:64。經(jīng)間接免疫熒光試驗和Western blot分析證明此抗體針對DEV gD蛋白有良好的反應性。
　　 對實時收獲的DEV感染后細胞裂解物提取總RNA，并進行RT-PCR檢測gD基因轉(zhuǎn)錄情況。DEV感染鴨胚成纖維細胞(DEF)后2h即可檢測出gD基因的轉(zhuǎn)錄，具有γ1基因的典型轉(zhuǎn)錄特征。以純化后的兔抗gDw IgG作為一抗，與病毒接種的DEF進行間接免疫熒光反應。4h核膜及核周囊泡首先

4、開始出現(xiàn)特異性綠色熒光，12h以后新合成的gD廣泛存在于胞漿中，72h gD集中于細胞膜上。
　　 在接種DEV的DEF培養(yǎng)液中添加兔抗gDw IgG，分別檢測gD蛋白在病毒的吸附、侵入、細胞到細胞間的直接傳播中的作用，以及對病毒體外復制的影響。結(jié)果表明，加入抗gDwIgG試驗組與對照組相比，病毒侵入率及形成的噬斑大小有明顯差異，但是吸附率差異不明顯，說明DEV gD參與病毒侵入和病毒在細胞間傳播的過程，對病毒的吸附作用無明顯影