鴨病毒性腫頭出血癥病毒感染特性及其免疫檢測技術的研究.pdf

1、1998-2003年四川省、重慶市、貴州省和云南省等養(yǎng)鴨省份發(fā)生了一種以鴨頭腫脹、眼結膜充血、出血，全身皮膚廣泛性出血，肝腫脹呈土黃色，并伴有出血斑點，體溫43℃以上，排草綠色稀糞等特征性的急性病毒性傳染病。該病目前給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。程安春等通過流行病學調(diào)查、臨床癥狀和病理學變化觀察、病理組織學檢查、病原的分離鑒定、人工感染試驗、電鏡觀察、防治試驗，確診為一種新的鴨病，并命名為“鴨病毒性腫頭出血癥(Duckviralswol

2、lenheadhemorrhagicdisease，DVSHD)”。國內(nèi)其他學者也稱之為“鴨傳染性腫頭癥”或“鴨腫頭敗血癥”。
　　 本病與鴨瘟在臨床特征和尸檢變化上有許多相似之處，鴨病毒性腫頭出血癥病毒(Duckswollenheadhemorrhagicdiseasevirus，DSHDV)是該病的病原。目前有關該病的研究資料報道較少，特別是有關DSHDV感染特性以及特異、敏感、快速的檢測方法等更是缺乏深入研究。因此，本文對

3、鴨病毒性腫頭出血癥病毒的對成年鴨和鴨胚感染特性以及相關的免疫檢測技術進行了一系列的研究。
　　 本研究獲得以下系列結果：
　　 1.鴨病毒性腫頭出血癥實驗感染模型的建立：本實驗用鴨病毒性腫頭出血癥病毒強毒（HY-99株）作為種毒，通過肌注、口服和滴鼻三種方式感染28日齡健康鴨，攻毒后每天觀察臨床癥狀和發(fā)病鴨及死亡鴨的剖檢變化。結果顯示，感染鴨出現(xiàn)以體溫升高、頭頸腫脹、眼結膜充血、出血、排灰白色或草綠色稀糞為主要特征的臨床

4、癥狀和肝臟腫大、出血呈土黃色、免疫器官和消化道嚴重充血、出血為主要特征剖檢變化。結果表明，臨床癥狀和剖檢變化與自然感染鴨基本一致，本實驗成功構建了鴨病毒性腫頭出血癥實驗感染模型。感染鴨各個組織器官進行了動態(tài)組織病理學變化觀察。結果表明，實驗感染模型中三組鴨出現(xiàn)的組織病理學變化基本一致，但時間存在差異：肌注組鴨于感染后72h內(nèi)、滴鼻組和口服組144h內(nèi)組織病理學變化以充血、出血和炎性細胞浸潤為主；肌注組鴨于感染72h后、滴鼻組和口服組14

5、4h后組織病理學變化以彌漫性出血、大小不等壞死灶或粘膜上皮細胞的壞死為主。免疫器官、消化腺、消化道、呼吸器官、心臟和腎臟等是主要的靶器官。這表明DSHDV是一種泛嗜性病毒，對全身各個組織器官具有嚴重破壞作用。
　　 3.DSHDV強毒在人工感染鴨宿主細胞內(nèi)的形態(tài)發(fā)生學和超微病理學研究：電鏡下，完整DSHDV粒子呈圓形或橢圓形，無囊膜，直徑為70nm-85nm。病毒粒子僅出現(xiàn)在感染細胞的胞漿中。電鏡下，可觀察到病毒粒子于感染4h后

6、吸附于法氏囊靶細胞表面，并通過細胞的內(nèi)吞作用進入細胞后，在胞漿內(nèi)脫去雙層衣殼，隨后在胞漿內(nèi)復制并合成病毒相關蛋白。這些合成結構蛋白、非結構蛋白及成熟或不成熟的病毒粒子在胞漿內(nèi)聚集成圓形、橢圓形或不規(guī)則形的包涵體結構。感染后24h-72h，病毒核酸在這些基質(zhì)上組裝和成熟形成完整的病毒粒子。感染144h后，成熟病毒通過細胞的崩解而釋放到細胞間隙。DSHDV強毒人工感染成年鴨后能夠引起宿主細胞明顯的超微結構變化（壞死和凋亡）。該病毒的主要靶器

7、官包括法氏囊、胸腺、脾臟、肝臟、消化道和腎臟等器官。病毒侵染靶細胞主要有：淋巴細胞、肝細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、上皮性網(wǎng)狀細胞、粘膜上皮細胞、腸腺細胞等。
　　 4.DSHDV強毒致人工感染鴨和鴨胚宿主細胞凋亡的研究：通過TEM法觀察發(fā)現(xiàn)，DSHDV經(jīng)尿囊腔感染10日齡鴨胚后尿囊膜上皮細胞、肝細胞、腸道上皮細胞和心肌細胞發(fā)生凋亡。凋亡細胞時間分布在感染后24h-96h，同時在部分宿主細胞的胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)少量病毒粒子。本研究利用HE

8、染色法、TEM法和TUNEL法三種方法均觀察到DSHDV感染誘導鴨宿主細胞的凋亡。發(fā)生凋亡的器官包括法氏囊、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、心臟、食管、腺胃和腸道。宿主細胞的凋亡指數(shù)從感染后2h到72h逐漸增加，72h達到最高值。感染72h后，瀕死鴨和死亡鴨宿主細胞死亡以典型壞死為主。DSHDV感染誘導的細胞凋亡在DVSHD的致病機制中起到重要作用。
　　 5.免疫酶組織化學檢測DSHDV抗原方法的建立和應用：本研究以兔抗DSHDVIg

9、G作為一抗、HRP-羊抗兔IgG作為二抗建立并優(yōu)化了在石蠟切片中檢測DSHDV抗原的間接免疫酶SP法，研究證實本方法具有較高的特異性和敏感性。該方法的應用研究揭示，三組鴨感染DSHDV后，肌注組(4h)、滴鼻組(12h)和口服組(24h)依次首先從法氏囊組織中檢測陽性信號，隨后抗原在多個組織中檢出，包括免疫器官、消化腺、消化道、腎臟、心臟、肺臟和氣管等。DSHDV侵染的靶細胞主要包括淋巴細胞、巨噬細胞、網(wǎng)狀細胞、粘膜上皮細胞、肝細胞、間

10、質(zhì)細胞、腺泡細胞、腸腺細胞、腎小管上皮細胞、心肌細胞和柱狀上皮細胞等。
　　 6.間接ELISA檢測鴨病毒性腫頭出血癥抗體方法的建立和應用：本研究以濃縮純化的DSHDV作為包被抗原，建立了檢測DSHDV抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。試驗最佳反應條件為：抗原最佳稀釋度為1：40，高免血清為1：80稀釋，最佳反應時間為60min；酶標抗體為1：2000稀釋，最佳反應時間為60min；封閉液為1％BSA-PBST，封閉時間