新型鴨病毒性肝炎病毒

1、新型鴨病毒性肝炎病毒巢式RTPCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用報(bào)告人：王梓1.鴨病毒性肝炎鴨病毒性肝炎(DuckViralHepatitisDVH)是由鴨病毒性肝炎病毒(DuckHepatitisVirusDHV)引起雛鴨的一種以肝臟為主要病理變化的急性、高度致死性、接觸性傳染性疾病。鴨病毒性肝炎在臨床上以發(fā)病急、傳播迅速、病程短、高死亡率為主要特征，該病主要侵害4周齡以內(nèi)的雛鴨10口齡以內(nèi)的雛鴨的死亡率高達(dá)90%~95%。1.1DHV的歷史與

2、分布鴨肝炎病毒(DHV)包括三個(gè)血清型，分別引起Ⅰ型Ⅱ型和Ⅲ型鴨病毒性肝炎。其中Ⅰ型鴨病毒性肝炎呈世界性分布。我國(guó)流行的鴨病毒性肝炎主要為Ⅰ型鴨病毒性肝炎，近年來(lái)陸續(xù)有新型鴨病毒性肝炎發(fā)現(xiàn)三個(gè)型之間無(wú)抗原相關(guān)性，沒(méi)有交叉保護(hù)和交叉中和作用。DHV最早發(fā)現(xiàn)是在1945年由Levine在美國(guó)發(fā)現(xiàn)了Ⅰ型鴨病毒性肝炎。該病呈世界性分布，曾在加拿大、意大利、法國(guó)、日本、美國(guó)和埃及等地流行、在我國(guó)廣東、北京、浙江、福建、四川、安徽、廣西、江蘇、山東

3、等地相繼發(fā)生該病、目前幾乎世界范圍內(nèi)主要養(yǎng)鴨地區(qū)均存在該病，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Ⅱ型鴨病毒性肝炎是1958年首先爆發(fā)于英格蘭諾?？锁唸?chǎng)，其他地區(qū)未見(jiàn)本病的報(bào)道。Ⅲ型鴨病毒性肝炎是1969年首次發(fā)現(xiàn)于美國(guó)紐約長(zhǎng)島地區(qū)。1999年，蘇敬良等和黃安國(guó)等在北京和廣西等地在3～13日齡疑似鴨肝炎的北京鴨和櫻桃谷鴨上分離到兩株與I型和III型DHV無(wú)血清學(xué)交叉免疫反應(yīng)的DHV，認(rèn)為出現(xiàn)了新的血清型，并將其命名為新型鴨肝炎病毒。新型鴨病毒性

4、肝炎的基因組與I型結(jié)構(gòu)相似，但比I型DHV基因組稍大。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)高變區(qū)主要存在于VP1和VP3基因、在VP1VP3基因上存在多個(gè)T細(xì)胞抗原表位和B細(xì)胞抗原表位，VP1基因的變異致使不同血清型DHV抗原性發(fā)生改變。1.2DHV的生物學(xué)特征2006年KimMC報(bào)道了I型DHV的全基因組序列，2007年TsengCH報(bào)道了DHV1型變異株全基因組序列，為DHV的研究做出了新的突破。DHV與其他小RNA病毒相比，DHV基因組具有一些特殊的結(jié)構(gòu)特

5、征TsengCH等建議將I型DHV歸為小RNA病毒科一個(gè)新的獨(dú)立的屬。T.Yun等構(gòu)建出了具有感染性的DHV全長(zhǎng)cDNA克隆，為進(jìn)一步揭示DHV基因組的結(jié)構(gòu)和功能及防控該病提供了良好的技術(shù)平臺(tái)。I型DHV基因組大小約為7690nt編碼2249aa、具有一個(gè)較大的開(kāi)放閱讀框(F)，在基因組RNA兩端各有一段保守的非編碼區(qū)I型DHV全基因組結(jié)構(gòu)依次為:5UTR(626nt)VPOVP3VPl2A12A22B2C3A3B3C3D3UTR(31

6、4nt)5UTR內(nèi)含有病毒翻譯起始所必需的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)I型DHV的IRES己報(bào)道具有8個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3’UTR內(nèi)含有病毒RNA復(fù)制和翻譯有關(guān)的poly(A)尾。I型DHV的3’UTR為314nt，新型DHV的3’UTR為366nt，均具有典型的小RNA病毒的基因組結(jié)構(gòu)、I型DHV多聚蛋白具有11個(gè)切割位點(diǎn)，且具有與小RNA病毒相似的切割位點(diǎn)和保守基因序列。基因組編碼區(qū)包含結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，分為3種初級(jí)前體分子P1P2

7、P3其中，P1前體蛋白裂解為組成病毒衣殼蛋白VP0VP3和VP1，3種結(jié)構(gòu)蛋白。P2和P3構(gòu)成病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。P2編碼2A12A22A32B和2C3種非結(jié)構(gòu)蛋白，P3編碼3A3B3C和3D4種非結(jié)構(gòu)蛋白。2.1非編碼區(qū)I型DHV基因組5‘UTR長(zhǎng)626nt內(nèi)含病毒翻譯起始所必需的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。在各病毒屬不同血清型之間，小RNA病毒IRES元件的序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)具有保守性，是病毒存活所必需的。小RNA病毒的IRES分為3

8、個(gè)型，I型IRES的病毒包括腸道病毒屬和鼻病毒屬，心臟病毒屬、口瘡病毒屬，雙?？虏《緦俚腎RES屬于II型IRES甲肝病毒屬的IRES屬于III型IRES。通過(guò)對(duì)I型DHV的RNA級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，I型DHV的5’UTR可能含有II型IRES的頸環(huán)結(jié)構(gòu)而沒(méi)有I型的三葉草結(jié)構(gòu)，據(jù)此推斷I型DHV的5’UTR區(qū)域會(huì)形成II型的IRESI型DHV的3’UTR長(zhǎng)為314317nt，新型DHV長(zhǎng)366nt，這在小RNA病毒基因組中是最長(zhǎng)的。有學(xué)者報(bào)

9、道I型DHV的3’UTR形成了5個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，參與病毒的復(fù)制，但它是否與宿主特異性有關(guān)還需進(jìn)一步研究。病毒的3’端poly(A)尾作為病毒RNA的負(fù)鏈合成起始位點(diǎn)，其長(zhǎng)度與負(fù)鏈RNA的合成效率及病毒RNA的感染能力有關(guān)。2.2編碼區(qū)DHV包含一個(gè)大的F，編碼一個(gè)多聚蛋白，多聚蛋白在翻譯過(guò)程中不斷被自身編碼的蛋白酶水解，從而分解成P1、P2和P3產(chǎn)物，P1、P2和P3又進(jìn)一步分別分解為VP0VP3VP12A12A22B2C3A3B3C3D、

10、I型DHV的多聚蛋白的切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)的結(jié)果是:VP0VP3和3C3D的切割位點(diǎn)為：QG2A32B2B2C2C3A3A3B以及3B3C的切割位點(diǎn)為QS；VP3VP1的切割位點(diǎn)為QM。多聚蛋白水解產(chǎn)生的多膚數(shù)量主要由以下因素決定:(1)基因組是否存在L蛋白。(2)VP0是否水解為VP4和VP2。(3)2A蛋白的數(shù)量。其也是小RNA病毒的基因組在不同的種屬之間存在的差異所在。小RNA病毒的基因組在不同的種屬間雖然存在差異，但是在病毒復(fù)制過(guò)程中具

11、有相似的功能、L蛋白作為前導(dǎo)蛋白2A是蛋白酶，參與多聚蛋白早期切割和宿主蛋白的合成關(guān)閉2B蛋白作為宿主范圍的決定因子2C蛋白是小RNA病毒中的保守序列，與病毒RNA合成相關(guān)3A蛋白與病毒毒力有關(guān)3B蛋白即VPg，是共價(jià)結(jié)合于正鏈和負(fù)鏈RNA5’末端的蛋白引物3C蛋白構(gòu)成大部分多聚蛋白，3C蛋白在病毒加工處理過(guò)程和RNA復(fù)制中產(chǎn)生，具有水解多聚蛋白活性，并且具有一個(gè)半胱氨酸作為親核作用的活性位點(diǎn).3D蛋白是RNA依賴的RNA聚合酶。2.2

12、.1結(jié)構(gòu)蛋白:P1區(qū)編碼病毒的殼體蛋白，包括VP0VP3VP1基因，核苷酸序列全長(zhǎng)2193nt、I型DHVVP0的N末端缺少GxxxST基因序列，因此其N末端可能未被十四烷基化，VP0不被蛋白酶切割為VP2和VP4。試驗(yàn)證明，殼體蛋白含有多個(gè)類似于其他小RNA病毒的核心結(jié)構(gòu)，即八鏈反向平行β桶結(jié)構(gòu)，與其相連的環(huán)形結(jié)構(gòu)位于殼粒表面，這在免疫學(xué)中占有重要作用。I型DHV的VP3與人腸道病毒(HumanparechovirusHPeV)一樣，

13、N一末端有一段殘基豐富區(qū)延伸出來(lái)，長(zhǎng)度約20aa這段區(qū)域在HPeV中具有很強(qiáng)的免疫原性但它在I型DHV是否也具有同樣的功能還未見(jiàn)報(bào)道。(1)VPl基因:小RNA病毒中VP1蛋白作為主要的宿主保護(hù)蛋白，具有特異性抗原中和位點(diǎn)，VP1蛋白多暴露于病毒表面，是決定病毒抗原性的主要成分，它能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體。I型DHV與其他小RNA病毒之間衣殼蛋白的氨基酸序列差異主要存在于VP1的兩端。何內(nèi)婭通過(guò)對(duì)華南地區(qū)分離到的I型和新型DHV的VP1

14、氨基酸序列比對(duì)分析表明:VP1包括了大部分的插入與缺失片段和高變異區(qū)，高變區(qū)主要分布在466495149180223位，尤其是C末端，存在點(diǎn)突變或連續(xù)變異。在第145146位，15株新型DHV毒株比3株I型DHV多2個(gè)氨基酸(G和G)。I型DHV和新型DHV的VP1蛋白不存在小RNA病毒科保守的RGD基序((ArgGlyAsp(RGD))而I型DHV相應(yīng)序列為SGD，而新型DHV為QSD，這表明DHV的病毒吸機(jī)制和復(fù)制能力存在差異還有待

15、于進(jìn)一研究。(2)VP3基因:VP3蛋白的N末端具有免疫原性，VP3的N端以及連接β鏈的環(huán)，特別是βBCβEF及βGH環(huán)的序列差異顯著、何內(nèi)婭通過(guò)對(duì)華南地區(qū)分離到的I型和新型DHV與參考毒株進(jìn)行VP3基因的變異分析，結(jié)果顯示，I型DHV和新型DHV的VP3基因不同點(diǎn)在于:第三位I型(R)→新型(K)，第15位I型(N)→新型(S)(除了臺(tái)灣新型)，第20位I型(P)→新型(S)，第22位I型(V)→新型(I)，第3940位I型(IA)→

16、新型(VT)，第45、69位I型(TI)→新型(AVV)，第78位～第107位為I型和新型DHV變異最多處，第125126位I型(MT)→新型(LL)，第143到第234位I型和新型DHV存在不連續(xù)的多位點(diǎn)不同，這些變異區(qū)是否影響I型和新型DHV的致病機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。2.2.2非結(jié)構(gòu)蛋白:(1)P2非結(jié)構(gòu)蛋白:小RNA病毒中，P2區(qū)長(zhǎng)2271ntI型DHV推測(cè)具有多達(dá)3種不同的2A蛋白，分別是2A12A2和2A3以及2B2C。DH

17、V的2A2蛋白是小RNA病毒多聚蛋白中的1個(gè)新蛋白，由161aa組成，可能參與病毒與宿主細(xì)胞之間相互作用，推測(cè)與病毒復(fù)制有關(guān)。2A3蛋白由124aa組成，含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域。2A3蛋白可能在控制細(xì)胞生長(zhǎng)方面起作用，目前關(guān)于小RNA病毒2B和2C蛋白的具體功能還不清楚。(2)P3非結(jié)構(gòu)蛋白:P3區(qū)編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白，分別是3A3B3C和3D。據(jù)報(bào)道，小RNA病毒科的病毒3A蛋白與病毒毒力有關(guān)。3BVPg蛋白包含34個(gè)as，這在小RNA病毒中是

18、最大的3B蛋白，并且與其他小RNA病毒的3B蛋白序列一致性很低，DHV的L(亮氨酸)被小RNA病毒KP基序中的K(賴氨酸)所取代，但是該蛋白第3位酪氨酸Tyr(Y)殘基卻很保守，它在VPg與基因組5’末端尿嘧啶的附著過(guò)程中起重要作用。DHV的3C蛋白酶是催化裂解小RNA病毒多聚蛋白中非結(jié)構(gòu)蛋白部分的關(guān)鍵酶，具有絲氨酸蛋白酶和半膚氨酸蛋白酶雙重特性，病毒編碼的3C蛋白酶完成多聚蛋白的大多數(shù)切割，通常發(fā)生在谷氨酞胺和甘氨酸之間的膚鍵(Gln

19、Gly)最終產(chǎn)生11個(gè)終末產(chǎn)物。DHV的3D蛋白是依賴RNA的RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase)3D蛋白在病毒RNA復(fù)制中起主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄及復(fù)制作用。2.新型鴨病毒性肝炎病毒巢式RTPCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用近年來(lái)，DVH在世界各地不斷發(fā)生，其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，養(yǎng)鴨比較集中的地區(qū)均遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的威脅，由于新型鴨病毒性肝炎病毒(NDHV)的存在，許多地區(qū)頻頻出現(xiàn)I型鴨病毒性肝炎病毒(DHV

20、I)免疫鴨群暴發(fā)鴨肝炎的報(bào)道，嚴(yán)重制約了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，不少學(xué)者己從發(fā)病鴨群中分離到工型鴨肝炎病毒的變異株(新型毒株NDHV)2007年，有學(xué)者先后證實(shí)新型DHV也具有典型的DHVI基因組結(jié)構(gòu)，但其與DHVI在序列上存在顯著差異，且新型DHV均不與DHVI產(chǎn)生交叉反應(yīng)。因此，加強(qiáng)NDHV病原診斷技術(shù)的研究對(duì)預(yù)防和控制鴨病毒性肝炎具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)選取新型DHV與傳統(tǒng)工型DHV差異序列區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了NDHV檢測(cè)的逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR

21、方法，旨在為新型鴨病毒性肝炎的早期診斷、流行病學(xué)調(diào)查等提供一種有效的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。2.1材料和方法2.1.1病毒NDHV、DHVⅠ、鴨病毒性腸炎病毒(DEV)、鴨細(xì)小病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)均由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。2.1.2主要試劑Trizol、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、RibonucleaseInhibit購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司ExTaq酶、pMD18T克隆載體及其他限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自

22、寶生物工程(大連)有限公司質(zhì)粒DNA提取試劑盒與膠回收試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。2.1.3引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)己發(fā)表的NDHV基因組序列，選取NDHV與DHVI差異序列區(qū)設(shè)計(jì)引物，利用生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)合成了2對(duì)引物，引物序列如下:第1輪擴(kuò)增引物:上游引物:ygpl5TUTUCCTUAUAAUCUUUATA3下游引物:ygp25CCUAAAUTUUAUATTAUUTG3‘第2輪擴(kuò)增引物:上游引物:ygp35CAUCCACAUCC

23、AUCUACAACr3下游引物:ygp45TTUCTCTUCUUTATCCTUCC3。2.1.4病毒基因組RNA的提取按Trizol試劑使用說(shuō)明提取NDHV基因組RNA，并提取其他幾種病毒的DNA或RNA。2.1.5RTPCR反應(yīng)2.1.5.1反轉(zhuǎn)錄合成cDNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按20μL體系操作，反轉(zhuǎn)錄條件為42℃作用60min后，95℃5min滅活反應(yīng)。2.1.5.2PCR反應(yīng)最適模板用量的確立分別以24681012μL反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板

24、，保持其他試劑濃度及反應(yīng)條件不變，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳模板用量。2.1.5.3PCR反應(yīng)最適引物用量的確立在50μLPCR反應(yīng)體系中分別加入不同用量的引物，上下游引物(20molL)分別入0.10.30.50.711.2μL對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳引物用量。2.1.5.4PCR反應(yīng)最適退火溫度的確立PCR反應(yīng)的退火溫度分別取5052545658℃，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳退火溫度

25、。2.1.5.5第1輪PLR擴(kuò)增反應(yīng)PCR反應(yīng)按50μL體系進(jìn)行，根據(jù)本試驗(yàn)確定的最適模板用量為10μL，最適引物用量為0.5μL，最適退火溫度為54℃，確定PCR反應(yīng)體系為:0.5μLExTaq(5UμL)、5μL10XExTaqBuffer5μLdNTP(2.5mmolL）、上下游引物ygp1、ygp2（20mo1L)各0.5、10μLcDNA，加水至50μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃4min94℃45s、54℃45s、，72℃60

26、s、30個(gè)循環(huán)72℃10min。2.1.5.6第2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR反應(yīng)按50μL，體系進(jìn)行，模板為第1輪PCR產(chǎn)物1μL，最適引物用量為0.5μL，最適退火溫度為54℃，確定PCR反應(yīng)體系為:0.5μLExTaq(5UpL)、5μL10XExTaqBuffer5μLdNTP(2.5mmolL)、上下游引物ygp3、ygp4(20molL)各0.5μL，加水至50μL。PCR反應(yīng)條件同2.1.5.52.6擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及鑒定首先取擴(kuò)

27、增產(chǎn)物5μL在10gL二的瓊脂糖凝膠上電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)掃描進(jìn)行初步鑒定。然后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD18T克隆載體于4℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株DH5α。挑取單個(gè)的轉(zhuǎn)化菌落，加LB溶液培養(yǎng)12h后用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，利用EcⅠHindⅢ雙酶切鑒定，陽(yáng)性的克隆送生工公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。將測(cè)序結(jié)果與NDHV毒株序列進(jìn)行同源性比較。2.7PCR特異性試驗(yàn)分別提取NDHV、DHVⅠNDVIBDV、健

28、康鴨肝組織的RNADEV、DPV的DNA，用己建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增。2.8PCR敏感性試驗(yàn)NDHV標(biāo)準(zhǔn)毒株提取RNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，使其分別相當(dāng)于含有10、1、0.1μL、10、1、0.1、0.01pgRNA的含量，分別進(jìn)行RTPCR檢測(cè)，確定其敏感性。在第2輪PCR中，利用上而不同的病毒RNA濃度進(jìn)行的RTPLR產(chǎn)物1μL為模板，進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)，反應(yīng)程序不變，確定巢式PCR的敏感性。2.9PCR重復(fù)

29、性試驗(yàn)用建立的巢式RTPCR檢測(cè)方法，對(duì)NDHV、DHVI、NDV、IBDV、DEV、DPV、健康鴨肝組織及檢測(cè)為新型鴨病毒性肝炎陽(yáng)性病料3份和陰性病料3份，重復(fù)檢測(cè)3次，以驗(yàn)證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。2.10初步應(yīng)用—臨床樣品檢測(cè)取疑似送檢病料21份，利用建立的RTPCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物全部進(jìn)行測(cè)序鑒定，并利用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列分析。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及鑒定3.1.1擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)10gL二

30、瓊脂糖凝膠電泳，第12輪擴(kuò)增產(chǎn)物在位于706、502bp處可見(jiàn)特異性DNA擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小相符。M：DL2000DNAMarkcr1、4：是2對(duì)引物的空白對(duì)照2：第1輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物3：第2輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物3.1.2克隆載體的酶切鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18T克隆載體上，根據(jù)病毒基因組的序列結(jié)構(gòu)，利用EcⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定。M：DL200CDNAMarkcr12：第12輪擴(kuò)增產(chǎn)物重組質(zhì)粒的EcⅠ和HindⅢ的雙酶切產(chǎn)物

31、3.1.3擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序鑒定挑取雙酶切鑒定正確的陽(yáng)性菌液送生工公司測(cè)序。DNA測(cè)序結(jié)果表明，插入到T載體的基因片段的核普酸序列為NDHV。3.2特異性試驗(yàn)結(jié)果利用設(shè)計(jì)的第1輪引物對(duì)NDHV擴(kuò)增出了706bp的目的基因片段，而DHVⅠ、NDVIBDV、健康鴨肝組織、DEVDPV均未擴(kuò)增出目的片段(圖3)。取PCR產(chǎn)物各1μL為模板，利用第2輪引物進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)，結(jié)果NDHV出現(xiàn)502bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而DHVⅠ、NDV、IBDV、健康鴨

32、肝組織、DEVDPV均未擴(kuò)增出目的片段(圖4)。第1輪擴(kuò)增的特異性試驗(yàn)M：DL2000DNAMarKer1:NDHV2:DHVⅠ3:NDV4:IBDV5:健康鴨的肝組織6.DEV7.DPV（圖3）第2輪擴(kuò)增的特異性試驗(yàn)M.:DL2000DNAMarker1:NDHV2:DHVⅠ3:NDV4:IBDV5.健康鴨肝組織6.DEV7.DPV（圖4）3.3敏感性試驗(yàn)結(jié)果2種引物敏感性試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物取5μL經(jīng)10gL二瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在

33、約706502bp附近出現(xiàn)特異性條帶，與各自的預(yù)期產(chǎn)物大小相符。從結(jié)果可以看出第1輪引物的RTPCR檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到10pgRNA，而第2輪引物的RTPCR檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.1pRNA。第1輪擴(kuò)增的敏感性試驗(yàn)M：DL2000DNAMarKer1~7：10、10.1μL、10、1、0.1、0.01pgRNA第2輪擴(kuò)增的敏感性試驗(yàn)M：DL2000DNAMarKer1~7：10、10.1μL、10、1、0.1、0.01pgRNA3.4重

34、復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)3次重復(fù)操作，結(jié)果一致，說(shuō)明建立的方法是穩(wěn)定可靠的。3.5臨床樣品檢測(cè)結(jié)果用建立的NDHV巢式RTPCR檢測(cè)方法，共檢測(cè)了21份在不同地采集的鴨病料。檢出陽(yáng)性樣品3份，對(duì)陽(yáng)性樣品PCR產(chǎn)物全部進(jìn)行克隆與序列分析，結(jié)果均為NDHV。4.討論由于NDHV在自然條件下感染成年鴨后，感染者可長(zhǎng)期帶毒和排毒而不出現(xiàn)臨床癥狀，在這些情況下，病鴨組織中病毒含量較低，而且組織樣品中因含有大量的蛋白和脂類等可能會(huì)影響PCR擴(kuò)增，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)

35、物直接用于PCR擴(kuò)增很難見(jiàn)到擴(kuò)增片段。巢氏PCR(nestedPCR)是PCR的一種改良模式，是指利用2對(duì)PLR引物進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。首先對(duì)靶DNA進(jìn)行第1步擴(kuò)增，然后從第1次反應(yīng)產(chǎn)物中取出少量作為反應(yīng)模板進(jìn)行第2次擴(kuò)增，第2次PCR引物與第1次反應(yīng)產(chǎn)物的序列互補(bǔ)，第2次PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物即為目的產(chǎn)物。由于巢式PCR反應(yīng)有2次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，增加了檢測(cè)的敏感性又有2對(duì)PCR引物與檢測(cè)模板的配對(duì)，增加了檢

36、測(cè)的可靠性。巢式RTPCR技術(shù)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR和巢式PCR的2次擴(kuò)增，首次反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移有助于稀釋掉那些最初可能存在于樣品中的抑制物，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，避免了樣品檢測(cè)過(guò)程中的假陰性問(wèn)題。巢式RTPCR技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速高效等特點(diǎn)，為鴨病毒型肝炎的早期診斷提供了新的模式。本試驗(yàn)參考UenBank中己發(fā)表DHVI和幾株NDHV的基因組序列，經(jīng)過(guò)多重序列比對(duì)分析。選取DHVI與NDHV序列變化差異明顯區(qū)設(shè)計(jì)合成2對(duì)新

37、型鴨病毒性肝炎的特異性引物，建立了NDHV檢測(cè)的巢式RTPCR檢測(cè)方法，該方法只對(duì)NDHV能夠特異性地?cái)U(kuò)增出706bp和502bp的目的片段，而對(duì)NDV、IBDV、DEV、DPV的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，具有良好的特異性，該方法第1次擴(kuò)增的敏感性為10pg，第2次擴(kuò)增的敏感性達(dá)到0.1Pg，敏感性提高了100倍，具有良好的敏感性。在21份臨床樣品的檢測(cè)過(guò)程中，利用第1輪RTPCR檢測(cè)出陽(yáng)性樣品2份，而利用巢式RTPLR檢測(cè)時(shí)可以檢出陽(yáng)性樣品3

38、份，將所有陽(yáng)性樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，序列分析結(jié)果顯示均是NDHV，說(shuō)明建立的巢式RTPLR檢測(cè)方法更為敏感、特異，可以用于原始病料中NDHV的快速低含量檢測(cè)，顯示出了良好的應(yīng)用前景。因此，本研究建立的巢式RTPCR方法將為國(guó)內(nèi)新型鴨病毒性肝炎的診斷、流行病學(xué)調(diào)查等提供一種簡(jiǎn)單快速的分子生物學(xué)診斷方法。鴨病毒性肝炎與鴨瘟鴨病毒性肝炎是引起雛鴨傳播迅速和高度致死的傳染病，病原為鴨肝炎病毒。鴨病毒性肝炎有3種血清型，在我國(guó)流行的主要為I

39、型。一般多發(fā)于1～5周齡的雛鴨對(duì)成年鴨沒(méi)有影響。對(duì)氯仿、乙醚、胰蛋白酶和pH值3的環(huán)境均有抵抗力。在56℃加熱60分鐘仍可存活，但加熱至62℃，30分鐘即被滅活。病毒在1%福爾馬林或2%氫氧化鈉中2小時(shí)、在2%漂白粉溶液中3小時(shí)、0.2%福爾馬林37℃，30分鐘均可使病毒滅活。鴨瘟是由鴨瘟病毒引起的急性、高度死亡率的傳染病，又稱為鴨病毒性腸炎，俗稱“大頭瘟”鴨瘟病毒是皰疹病毒，病毒粒子呈球形。病毒對(duì)外界抵抗力不強(qiáng)。病毒對(duì)乙醚和氯仿敏感。

40、病毒在pH值7～9時(shí)，經(jīng)6小時(shí)不減低毒力，在pH值3和11時(shí)，病毒迅速滅活。各種年齡和品種的鴨均可感染，但鴨瘟流行時(shí)，成年鴨發(fā)病和死亡較嚴(yán)重，1月齡以下的雛鴨發(fā)病較少。本病于全年各季均可發(fā)生，但以春夏之交和秋季最易流行。本病主要通過(guò)消化道傳播，也可通過(guò)交配、眼結(jié)膜和呼吸道而傳播。鴨病毒性肝炎臨床上主要表現(xiàn)為雛鴨突然發(fā)病，身體側(cè)翻仰臥，頭向后背雙腳痙攣后蹬，角弓反張。主要病變?cè)诟闻K，肝臟腫大，質(zhì)脆，色暗或發(fā)黃，肝臟表面有大小不等的出血點(diǎn)，

41、膽囊腫脹呈長(zhǎng)卵圓形，充滿膽汁，膽汁呈褐色，淡茶色或淡綠色，脾有時(shí)見(jiàn)有腫大呈斑駁狀。許多病例腎腫脹與充血。死亡率高達(dá)90％以上。鴨瘟臨床表現(xiàn)為精神不佳，食欲減少或停食，渴欲增加，喜臥不愿走動(dòng)病初，體溫升高到43℃以上。流淚、眼周圍羽毛粘濕，甚至有膿性分泌物，將眼瞼粘連。鼻腔亦有分泌物，部分病例頸部腫大。病鴨下痢，排綠色或灰白色稀糞。剖檢病變主要在消化道，食道黏膜有縱行排列的灰黃色假膜覆蓋或小出血斑點(diǎn)，假膜易剝離，剝離后食道黏膜留有潰瘍斑痕

42、，這種病變具有特征性。泄殖腔黏膜有出血或潰瘍，小腸有出血環(huán)，心臟有出血點(diǎn)，肝臟微腫脹、有大小不等的灰黃色或灰白色的壞死點(diǎn)鴨瘟患鴨以食道、泄殖腔和眼瞼黏膜呈出血性潰瘍和假膜為主要特征性病變，與患鴨病毒性肝炎完全不同。鴨病毒性肝炎患鴨肝臟有明顯腫大并且有大小不等的出血點(diǎn)，而鴨瘟患鴨肝臟以灰黃色或灰白色的壞死點(diǎn)為主要癥狀。病理變化的區(qū)別防治措施鴨病毒性肝炎首先要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。引進(jìn)健康雛鴨苗，1月齡以內(nèi)的雛鴨要隔離飼養(yǎng)，供給需要的維生素、礦物質(zhì)

43、，飲用自來(lái)水或深井水，不得飲用野生水禽棲息的水。用具要清洗、消毒。用鴨病毒性肝炎I型弱毒疫苗進(jìn)行免疫接種，成鴨于產(chǎn)蛋前半個(gè)月，肌肉注射1~2份只，產(chǎn)蛋中期，肌肉注射2~4頭份只。雛鴨出殼后1日齡或7日齡皮下注射1頭份只。在疫區(qū)對(duì)雛雞也可于1~2日齡皮下注射高免血清或卵黃）或康復(fù)鴨的血清，每只0.3~0.5毫升，可以預(yù)防感染或減少病死。一旦確診可注射鴨病毒性肝炎卵黃抗體（或高免血清）進(jìn)行治療。預(yù)防鴨瘟要避免從疫區(qū)引進(jìn)鴨，如必須引進(jìn)，一定要

44、經(jīng)過(guò)嚴(yán)格檢疫，并經(jīng)隔離飼養(yǎng)2星期以上，證明健康后才能合群飼養(yǎng)。還要禁止在鴨瘟流行區(qū)域和野水禽出沒(méi)區(qū)域放牧。平時(shí)對(duì)禽場(chǎng)和工具進(jìn)行定期消毒，被病毒污染的飼料要進(jìn)行高溫消毒，飲用水可用碘氯類消毒藥消毒，工作人員的衣、帽等及飼養(yǎng)所用工具也要嚴(yán)格消毒。目前，該病的防制主要依靠疫苗，在受威脅區(qū)內(nèi)，應(yīng)注射鴨瘟弱毒疫苗。產(chǎn)蛋鴨適宜安排在停產(chǎn)期或開(kāi)產(chǎn)前1個(gè)月注射。肉鴨一般在20日齡以上注射1次即可。發(fā)生鴨瘟?xí)r應(yīng)立即采取隔離和消毒措施，對(duì)鴨群用疫苗進(jìn)行緊急