輪狀病毒感染誘導(dǎo)MA104細(xì)胞感染相關(guān)蛋白的分析鑒定.pdf

1、輪狀病毒感染是全世界范圍內(nèi)嬰幼兒腹瀉的主要病因。MA104細(xì)胞是研究輪狀病毒感染生物學(xué)的理想宿主細(xì)胞。對(duì)輪狀病毒感染后宿主細(xì)胞基因表達(dá)的變化，通過(guò)RT-PCR、Northern blotting及cDNA微陣列的方法進(jìn)行了很多研究，但是蛋白質(zhì)才是生命活動(dòng)的最終體現(xiàn)者。為了揭示輪狀病毒的致病機(jī)理及宿主細(xì)胞對(duì)輪狀病毒感染的反應(yīng)特點(diǎn)，我們用蛋白組技術(shù)對(duì)輪狀病毒感染前后胞內(nèi)蛋白表達(dá)譜的變化情況進(jìn)行研究。首先建立輪狀病毒感染MA104細(xì)胞模型。我

2、們代表性的選用非唾液酸(SA)依賴的人源輪狀病毒W(wǎng)a株和唾液酸依賴的猿猴輪狀病毒SA11株，從對(duì)MA104細(xì)胞感染能力、胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制能力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡壞死能力等方面進(jìn)行觀察，確定了輪狀病毒感染MA104細(xì)胞的合適條件：輪狀病毒W(wǎng)a株以MOI=2，SA11株以MOI=8感染MA104細(xì)胞12h，既能保證較高的感染率，又使宿主細(xì)胞病變不過(guò)于嚴(yán)重，細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完整，為進(jìn)行感染后細(xì)胞蛋白表達(dá)譜研究的理想選擇。 為了分析感染病毒后宿主細(xì)胞

3、蛋白表達(dá)譜的變化，用13cm pH3-11NL的IPG預(yù)制膠條做IEF，雙向電泳分析感染了輪狀病毒及模擬感染的MA104細(xì)胞蛋白譜表達(dá)情況。Wa株感染組分別可檢測(cè)出772和798個(gè)蛋白點(diǎn)，SA11感染組分別可檢測(cè)出1230和1312個(gè)蛋白點(diǎn)。通過(guò)圖像分析及膠與圖像的比對(duì)，重復(fù)3次，發(fā)現(xiàn)Wa株感染組，感染12h后，有14個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)2倍以上，37個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)50％以上；SA11株感染組，感染12h后，有24個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)2倍以上

4、，29個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)50％以上。而在這些上調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)中，Wa株感染組與SA11感染組僅發(fā)現(xiàn)2個(gè)在等電點(diǎn)及分子量接近，提示可能為相同的蛋白。鑒于輪狀病毒感染后會(huì)引起細(xì)胞蛋白表達(dá)的普遍下降，那些感染后表達(dá)反而上調(diào)的蛋白在輪狀病毒于宿主細(xì)胞相互作用中似更有意義，所以我們選擇在感染后表達(dá)上調(diào)的蛋白點(diǎn)用于蛋白鑒定。 為了鑒定輪狀病毒感染后宿主細(xì)胞內(nèi)上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)，我們采用MALDI-TOF-MS技術(shù)，并通過(guò)mascot用NCBIn

5、r數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。由于考慮到MA104細(xì)胞為猿猴來(lái)源，同時(shí)選取的蛋白中可能也會(huì)有病毒表達(dá)的蛋白質(zhì)，我們對(duì)每個(gè)點(diǎn)同時(shí)搜索了靈長(zhǎng)類和病毒兩個(gè)庫(kù)。輪狀病毒wa株感染組，送檢11蛋白點(diǎn)，檢出陽(yáng)性結(jié)果7個(gè)，排除蛋白質(zhì)的種屬特性，其中兩個(gè)為同一蛋白HSP27，其它分別為與zeta晶體蛋白高度同源的未命名的蛋白產(chǎn)物(gi｜90085272)，理論上蛋白質(zhì)(gi｜114583139)，環(huán)戊烷介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)受體(hyaluronan-mediated

6、motility receptor(RHAMM))，輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP3，角蛋白8。輪狀病毒SA11株感染組，送檢16個(gè)蛋白點(diǎn)，陽(yáng)性點(diǎn)4個(gè)，除去種屬差異性，分別為輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP3，plectin1 isoform 6，cortactin-binding protein 2與leucine-zipper-like transcription regulator,1isoform 1的復(fù)合物，KRT8 protein與ret

7、iculocalbin 1的復(fù)合物。這些蛋白可能與抑制宿主蛋白表達(dá)、胞內(nèi)信號(hào)傳遞、胞內(nèi)代謝、病毒復(fù)制與運(yùn)輸及宿主細(xì)胞發(fā)育分化相關(guān)，顯示出輪狀病毒感染后對(duì)宿主細(xì)胞的改造，使之適合于自身在胞內(nèi)生存。 為了對(duì)蛋白質(zhì)譜鑒定的結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)，我們選取HSP27進(jìn)行驗(yàn)證。Western blot顯示，在被輪狀病毒W(wǎng)a株感染12后，MA104細(xì)胞HSP27表達(dá)顯著上升。用SA11感染MA104，同樣可發(fā)現(xiàn)HSP27表達(dá)明顯上調(diào)，這可能是由于質(zhì)