番鴨細(xì)小病毒的分離鑒定、VP基因的克隆及其原核表達.pdf

1、番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒(Muscovy Duck Parvovirus，MDPV)引起的，以1-3周齡雛番鴨為易感的一種急性傳染性病毒病，臨床以腹瀉、呼吸困難、腳軟、滲出性腸炎為主要癥狀，死亡率約50-80％。我國福建省1980年首次發(fā)現(xiàn)番鴨細(xì)小病毒病，以后我國南方的番鴨養(yǎng)殖場以及法國、美國、日本等地相繼報道了本病的流行。該病的流行嚴(yán)重制約了番鴨養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。 抗原表位義稱抗原決定簇，是抗原分子上能夠被抗體分子識別的部位

2、，在蛋白質(zhì)抗原中一般由幾個直接相鄰或構(gòu)象上相鄰的氨基酸組成，決定著機體產(chǎn)生抗體的特異性，是誘導(dǎo)體液免疫的基本單位。對于MDPV來說，尋找病毒的保護性抗原表位對該病的診斷和免疫防治都是很重要的。MDPV的VP基岡相互重疊，編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白的基因分別是VP1(89KD)、VP2(78KD)和VP3(61KD)，它們的起始密碼子ATG分別位于2450nt、2885nt和3044nt，終止密碼子位點相同，位于4646nt，基因長度是VP1＞VP

3、2＞VP3。編碼的這3種蛋白是暴露于病毒粒子表面的衣殼蛋白。其中VP2可能是病毒重要的保護性抗原成分，而VP1、VP3為構(gòu)成病毒粒子的重要結(jié)構(gòu)成分，免疫原性較弱。 收集疑似細(xì)小病毒感染的雛鴨病料，應(yīng)用PCRPS(PCR products sequencing)方法檢測MDPV。采用Chang-kwang Limn報道的AL18R2/AL18F2引物對20份來自四川、重慶、福建、廣西及山東地區(qū)的疑似細(xì)小病毒感染的雛鴨病料DNA進行

4、PCR擴增，8份病料的DNA PCR擴增出現(xiàn)陽性結(jié)果，它們分別是GX、CQ-2、CQ-16、FL-1、FL-2、DY、FJ和SC-14?；厥誔CR產(chǎn)物進行測序，測得的序列與MDPV標(biāo)準(zhǔn)株FM株和GPV標(biāo)準(zhǔn)株B株進行比對。結(jié)果顯示只有FJ的序列與MDPV標(biāo)準(zhǔn)株(FM株)的同源性最高，其余7份陽性病料與GPV標(biāo)準(zhǔn)株(B株)有更高的同源性。用鴨胚對保存的福建雛鴨病料組織進行病毒分離培養(yǎng)，成功分離到MDPV毒株，命名為FJ株。 應(yīng)用CH

5、U CY報道的引物GR/GF和參考番鴨細(xì)小病毒FM株設(shè)計的引物MF1/MR1分別擴增FJ株的VPl基因和VP2基因，通過克隆測序、拼接校正最后得劍完整的VP基因，也就是得到了VP1、VP2和VP3基因。將VP基因同MDPV FM株(GenBank登錄號：NC_006147)、廣東株(GenBank登錄號：AY510603)、法國株(GenBank登錄號：Z68272)以及GPV B株(GenBank登錄號：U25749)、臺灣株(Gen

6、Bank登錄號：AY382889)的核苷酸序列以及推導(dǎo)出的氨基酸序列進行同源性比對和系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果顯示FJ株與3種MDPV毒株高度同源，其中與廣東株同源性最高，核苷酸序列同源性達到99.2％，推導(dǎo)氨基酸序列同源性高達98.5％。與MDPV FM株的序列相比FJ株VP2起始密碼第二位堿基由T突變成了C，形成同GPV VP2起始密碼相同的密碼子ACG。采用DNAStar的Protean分析軟件按Kyte-Doolittle的氨基酸親水

7、性標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測VP基因推導(dǎo)出的氨基酸的親水性；采用Emini程序預(yù)測VP氨基酸的表面可及性；按Jameson-Wolf方案預(yù)測抗原指數(shù)。最后結(jié)合MDPV的高級結(jié)構(gòu)特征預(yù)測出FJ株VP2氨基端146-190氨基酸殘基區(qū)域和240-340氨基酸殘基區(qū)域為可能的抗原表位位置。在這段區(qū)域兩端設(shè)計引物，并擴增它。將擴增產(chǎn)物連接到到pET28b(+)載體上，重組的載體命名為pFJ。對重組載體進行原核生物誘導(dǎo)表達，獲得表達蛋白，通過SDS-PAGE電泳，