鴨α-干擾素基因的原核表達(dá)及抗病毒活性研究.pdf

1、鴨α-干擾素成熟蛋白基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及生物活性研究根據(jù)本課題組克隆、構(gòu)建的PBV220-IFN (ORF)序列，利用permer5.0設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出成熟蛋白基因并克隆到PMD18-T載體，測(cè)序鑒定后將其連接到原核表達(dá)載體pET32a<'+>，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)后獲得高效表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白分子量大小約37 KDa，以包涵體形式存在，占菌體總蛋白的30％。重組蛋白經(jīng)鎳金屬螯合介質(zhì)填料(Ni-MIA

2、C)后得到純化。 利用稀釋復(fù)性和柱上復(fù)性兩種方法對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性，以在DEF上抗VSV的生物學(xué)活性效價(jià)檢測(cè)其效價(jià)。稀釋復(fù)性中，通過添加L-Arg使鴨α-干擾素成熟蛋白得到初步復(fù)性，表現(xiàn)出800U/mg的抗VSV活性，對(duì)柱上復(fù)性的鴨α-干擾素成熟蛋白，得到比活力為12800U/mg的DuIFN-α成熟蛋白。 利用定量PCR的方法對(duì)受30U(15U/ml)DuIFN-α成熟蛋白保護(hù)的鴨胚層纖維細(xì)胞(DEF)中的DPV強(qiáng)毒進(jìn)行

3、抗病毒活性檢測(cè)。結(jié)果顯示：在DPV感染后15 h內(nèi)，重組鴨α-IFN抗DPV組的病毒核酸拷貝數(shù)與不加鴨α-IFN的陽性對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05)；從23h開始鴨α-IFN保護(hù)組的核酸拷貝數(shù)低于陽性對(duì)照組并在感染后47h-55h其拷貝數(shù)差異達(dá)到最大，差異顯著(P<0.05)；與陽性對(duì)照組的DPV拷貝數(shù)相比，鴨α-IFN保護(hù)組在55h時(shí)能減少病毒10<'8.83>個(gè)核酸拷貝數(shù)，相對(duì)抑制率為80％。表明重組鴨α-IFN能明顯抑制對(duì)數(shù)

4、期的DPV復(fù)制，具有進(jìn)一步臨床應(yīng)用的潛力。 鴨α-干擾素ORF序列的原核表達(dá)及生物活性研究根據(jù)本課題組克隆、構(gòu)建的PBV220-IFN ORF序列，利用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切其ORF后連接到原核表達(dá)載體pET32a<'+>，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白分子量大小約42 KDa，以包涵體形式存在。利用鎳金屬螯合介質(zhì)填料對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化和柱上復(fù)性。對(duì)復(fù)性的鴨α-干擾素ORF，利用鴨α