ELP融合犬β干擾素的表達、純化、抗病毒活性及體外半衰期研究.pdf

1、盡管犬疫苗接種較為普遍，但由于疫苗質(zhì)量、使用方法和病毒變異等原因，犬細小病毒病、犬瘟熱、犬病毒性肝炎等傳染病流行仍較普遍。Ⅰ型干擾素（interferon，IFN）是具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子，其中犬重組α干擾素(CaIFN-α)廣泛用于犬病毒病的治療，并取得良好的治療效果。但現(xiàn)有的犬重組α干擾素多為組氨酸標(biāo)簽融合蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式表達，需要經(jīng)過變性、復(fù)性和親和層析法純化，不僅價格較高，而且體內(nèi)半衰期較短。延長

2、干擾素體內(nèi)半衰期的主要策略有聚乙二醇化和與血清白蛋白等進行融合表達，前者的反應(yīng)條件和產(chǎn)品質(zhì)量較難控制，后者仍需親和層析等方法純化。類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide，ELP)是一類根據(jù)體內(nèi)彈性蛋白重復(fù)序列合成的五肽聚合物，具有溫度敏感的可逆相變特性，可用離心等簡單方法分離純化，因此ELP已被用作重組蛋白的純化標(biāo)簽。另外，ELP還被用作體內(nèi)藥物傳送載體，以起到緩釋和延長半衰期作用。
　　犬β干擾素(Ca

3、IFN-β)與CaIFN-α具有類似的抗病毒作用，但目前尚無基因工程產(chǎn)品上市。本研究用PCR擴增CaIFN-β成熟肽編碼序列，分別將其插入原核表達載體pET-30a和ELP融合表達載體pET-ELP，獲得重組載體pET-CaIFNβ和pCaIFNβ-ELP。分別將重組載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌，在不同溫度下用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示:在37℃條件下His-CaIFNβ和CaIFNβ-ELP融合蛋白均

4、獲得正確表達，但表達產(chǎn)物均為不可溶性包涵體。為了獲得可溶性表達產(chǎn)物，對兩種融合蛋白的誘導(dǎo)表達溫度進行了優(yōu)化，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示:CaIFNβ-ELP融合蛋白在低于30℃條件下主要以可溶性蛋白表達，而His-CaIFNβ融合蛋白即使在20℃條件下仍以不溶性包涵體表達，表明ELP可增加CaIFN-β的可溶性。在次基礎(chǔ)上對IPTG誘導(dǎo)CaIFNβ-ELP融合蛋白表達的濃度和時間進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示:在20℃條件下，0.1～1.0 m

5、M IPTG均能誘導(dǎo)CaIFNβ-ELP融合蛋白表達，其中0.2 mM IPTG誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的量較多，但差異不顯著;在6～24h時間內(nèi)，CaIFNβ-ELP融合蛋白表達量隨誘導(dǎo)時間的延長呈上升趨勢，誘導(dǎo)18h的表達量最高。這些研究結(jié)果為兩種融合蛋白的純化及抗病毒活性研究打下基礎(chǔ)。
　　分別在優(yōu)化條件下進行His-CaIFNβ和CaIFNβ-ELP融合蛋白誘導(dǎo)表達。His-CaIFNβ融合蛋白經(jīng)過變性、復(fù)性后進行鎳親和柱層析純化，結(jié)

6、果顯示:融合蛋白純度為85％，產(chǎn)量為50 mg/L細菌培養(yǎng)。CaIFNβ-ELP融合蛋白用相變循環(huán)(ITC)純化，并對相變溫度、氯化鈉濃度和離心力等參數(shù)進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示:CaIFNβ-ELP融合蛋白的相變溫度為28℃，氯化鈉濃度為2.0 mol/L，適宜離心力為12000 g。用優(yōu)化ITC條件進行CaIFNβ-ELP融合蛋白純化，純化產(chǎn)物用4 mol/L尿素溶解，透析后進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示:CaIFNβ-ELP融合蛋白

7、的純度達96％，產(chǎn)量可達220 mg/L。以MDCK細胞/水泡性口炎病毒系統(tǒng)進行干擾素活性檢測，結(jié)果顯示:His-CaIFNβ融合蛋白的抗病毒效價為104 U/mg，CaIFNβ-ELP融合蛋白的抗病毒效價為105 U/mg。血清穩(wěn)定性檢測結(jié)果顯示，CaIFNβ-ELP融合蛋白的體外半衰期大于24h，顯著高于His-CaIFNβ融合蛋白的12h。這些研究結(jié)果表明，ELP是有效的CaIFN-β表達和純化標(biāo)簽，純化的CaIFNβ-ELP融合