洋蔥果膠甲酯酶基因AcPME的克隆、原核表達及亞細胞定位.pdf

1、洋蔥（Allium cepa L.）在分類學(xué)上屬于天門冬目石蒜科蔥亞科蔥屬（APGIII）蔬菜作物，廣泛栽培于世界各地。因其基因組巨大（15,290 Mbp/C），分子生物學(xué)基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究相對薄弱，主要集中在育性、顏色相關(guān)基因的分子標記上，而關(guān)于洋蔥功能基因的研究甚少。果膠甲酯酶[pectin methylesterase，PME]是一類催化果膠復(fù)合物中甲酯化的 D-半乳糖醛酸單元去甲酯化的一類細胞壁蛋白，根據(jù)其保守的結(jié)構(gòu)域該酶組成了一

2、個巨大的基因家族，在植物不同的生長發(fā)育階段及其不同的生理過程中，通過作用于細胞壁而發(fā)揮作用。已有的研究發(fā)現(xiàn)，果膠甲酯酶參與了多種生理過程，如果實成熟、器官脫落、小孢子發(fā)育和花粉管伸長、種子萌發(fā)、抗病性、形成層細胞分化等。
　　本試驗在研究洋蔥育性相關(guān)基因差異表達的過程中，發(fā)現(xiàn)了一個大小約為350 bp的差異表達片段始終只在可育材料中出現(xiàn)，克隆了其編碼序列。蛋白質(zhì)序列比對顯示，該基因表達的蛋白具有果膠甲酯酶結(jié)構(gòu)域，屬于果膠甲酯酶超家

3、族成員。本研究以洋蔥育性恢復(fù)系12-10（S, MsMs）為研究材料，利用基因克隆、序列分析、原核表達、生物活性分析及基因槍技術(shù)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮等方法，從分子生物學(xué)實驗層面初步證明了洋蔥AcPME基因是一個在洋蔥花粉發(fā)育過程中表達的具有PME蛋白活性的定位于細胞壁或細胞膜的PME蛋白超家族成員。本研究結(jié)果如下：
　　（1）以洋蔥花蕾為試材，通過RACE實驗獲得了AcPME基因的表達序列；蛋白同源比對與系統(tǒng)進化分析表明，洋蔥 PME蛋白

4、與水稻、玉米、高粱等單子葉植物的同源蛋白具有較高的相似性；生物信息學(xué)分析表明，AcPME蛋白存在明顯的信號肽和跨膜區(qū)域（SP/TM）、PMEI結(jié)構(gòu)域和PME結(jié)構(gòu)域，在PME家族分類中屬于第一類，即含有一個長 N末端前區(qū)域（pro-region）；AcPME蛋白三維結(jié)構(gòu)模式圖顯示了該蛋白具有一個明顯的凹溝，4個結(jié)合位點氨基酸殘基（T423、Q453、R565和W567），2個活性位點氨基酸殘基（D476和D497）。
　?。?）成功

5、構(gòu)建了 pGEX4T-1-PME和 pET24a-PMEI原核表達載體，并在大腸桿菌BL21（DE3）菌株中進行了表達條件的優(yōu)化，確定了pGEX4T-1-PME表達條件為17℃，0.3 mM IPTG誘導(dǎo)4 h；pET24a-PMEI蛋白表達條件為37℃，0.1 mM IPTG誘導(dǎo)4 h。SDS-PAGE電泳檢測明確了重組蛋白的存在形式，原核表達蛋白pGEX4T-1-PME為可溶性蛋白，而 pET24a-PMEI蛋白則以包涵體形式存在；

6、表達蛋白對應(yīng)的分子量分別約為61.73 kD和24.67 kD，與目的蛋白預(yù)期大小相符。
　　（3）利用GST-tag純化柱對pGEX4T-1-PME表達產(chǎn)物純化了目的蛋白，同時利用His-tag純化柱采用柱上復(fù)性的方法純化了目的蛋白pET24a-PMEI，獲得了GST-PME和PMEI-6×His純化蛋白。
　?。?）生物活性分析表明pGEX4T-1-PME(PME)具有明顯的PME活性；pET24a-PMEI（PMEI）