NDV F和HN基因克隆分析及HN基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是禽類新城疫病(ND)的病原，為單股負(fù)鏈RNA病毒。病毒基因組編碼NP、P、M、F、HN、L六種特異性結(jié)構(gòu)蛋白，其中HN蛋白和F蛋白是重要的宿主保護(hù)性抗原，與病毒的致病性和毒力密切相關(guān)。HN蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性，在病毒侵染過(guò)程中起識(shí)別細(xì)胞受體、介導(dǎo)病毒吸附細(xì)胞膜的作用，并在感染過(guò)程中具有促融合的作用。而F基因是決定NDV毒力強(qiáng)弱的主要因素。該病經(jīng)過(guò)多年的防制，

2、現(xiàn)已基本控制了該病的流行。近年來(lái)，我國(guó)新城疫的發(fā)生出現(xiàn)了新的特點(diǎn)，即非典型新城疫病例日益增多，高抗體雞群發(fā)病等。許多學(xué)者認(rèn)為這可能與NDV毒株變異有關(guān)。因此，開展NDV的病原研究及新型疫苗的開發(fā)顯得尤為重要。本試驗(yàn)首先對(duì)濱州及其周邊地區(qū)的6株新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)分離株進(jìn)行了F基因和HN基因的克隆及序列分析，確定了其毒力強(qiáng)弱、進(jìn)化地位及基因型，為研究新城疫分子流行病學(xué)特點(diǎn)和綜合防制措施提供了

3、依據(jù)。本研究成功構(gòu)建了基因Ⅶ型NDV HN基因的真核及腺病毒表達(dá)載體，為研究新型NDV基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)6個(gè)NDV分離株(DZNDV/001、DZNDV/004、DZNDV/005、DZNDV/006、DZNDV/007、DZNDV/008)的F基因和HN基因進(jìn)行了擴(kuò)增，各擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測(cè)序后與GeneBank登陸的NDV參考毒株的F基因及HN基因進(jìn)行核苷酸序列分析。結(jié)果表明，

4、NDV分離毒株間F基因核苷酸同源性在79.6％-100％之間，并且分離毒株DZNDV/001、DZNDV/004、DZNDV/005、DZNDV/006、DZNDV/008與基因Ⅱ型參考毒株B1、Lasota、HB92、Clone30等同源性在92.9％-99.9％之間;推導(dǎo)其氨基酸序列分析表明，分離毒株DZNDV/001、DZNDV/004、DZNDV/005、DZNDV/006、DZNDV/008 F蛋白的裂解位點(diǎn)均為112GRQG

5、RL117，具有NDV弱毒株裂解位點(diǎn)氨基酸組成特征，與毒力指標(biāo)測(cè)定結(jié)果相符。分離毒株DZNDV/007與基因Ⅶ型參考毒株KBNP-4152、NA-1等同源性在90.6％-97.6％之間;推導(dǎo)其氨基酸序列分析表明，分離毒株DZNDV/007 F蛋白的裂解位點(diǎn)為112RRQKRF117，具有NDV強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)氨基酸組成特征，與毒力指標(biāo)測(cè)定結(jié)果相符。NDV分離毒株間HN基因核苷酸同源性在77.2％-100％之間，并且分離毒株DZNDV/00

6、1、DZNDV/004、DZNDV/005、DZNDV/008與基因Ⅱ型參考毒株B1、Lasota、HB92、Clone30等同源性在97.1％-99.4％之間;分離毒株DZNDV/006、DZNDV/007與基因Ⅶ型參考毒株KBNP-4152、NA-1等同源性在88.9％-91.7％之間;值得注意的是DZNDV/006株HN基因與基因Ⅶ型的DZNDV/007及基因Ⅶ型參考毒株NA-1、KBNP-4152等處于同一進(jìn)化分支，同源性達(dá)88

7、.9％-91.7％，可能為基因Ⅱ型與基因Ⅶ型天然重組株，有待進(jìn)一步研究。
　　2.設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增Ferritin和基因Ⅶ型NDV HN基因，并利用重疊延伸PCR將Ferritin與HN基因串聯(lián)，插入真核表達(dá)載體pCI-neo中，將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，通過(guò)SDS-PAGE和Western-blot鑒定了其正確表達(dá)。本研究首次成功地將Ferritin與NDV HN基因串聯(lián)真核表達(dá)。這為研制新型NDV基因工程疫苗奠定了

8、基礎(chǔ)。
　　3.設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因Ⅶ型NDV HN基因，并將其插入穿梭載體pShuttle-CMV中，經(jīng)pmeⅠ線性化后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183（內(nèi)含pAdEasy-1骨架質(zhì)粒）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)pacⅠ鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增病毒并純化質(zhì)粒，用pacⅠ完全線性化重組病毒質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染于293A細(xì)胞，約7-10d左右出現(xiàn)細(xì)胞病變，通過(guò)PCR和Western-blot鑒定該腺病毒重組表達(dá)載體構(gòu)建正確并且HN蛋白正確表達(dá)。