雞新城疫病毒F、HN基因的真核表達(dá)及免疫效力研究.pdf

1、新城疫(Newcastledisease,ND)是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)引起的侵害禽類的急性高度接觸性傳染病，是家禽傳染性疾病中危害最嚴(yán)重的疫病之一，由于對(duì)世界養(yǎng)禽業(yè)危害極大，故被國(guó)際獸疫局確定為A類傳染病。使用疫苗進(jìn)行免疫是全球養(yǎng)禽業(yè)防制該病的有效方法之一。由于傳統(tǒng)疫苗(減毒活苗或滅活苗)潛在的不足，迫切需要提高和加強(qiáng)新城疫疫苗的有效性。DNA疫苗作為第3代疫苗，因其既有亞單位疫苗的安全性，

2、又有減毒活疫苗的有效性而受到研究人員的矚目。因此，研制新一代高效、安全，低副作用的NDDNA疫苗是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一。 本研究將新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E9株F、HN基因分別克隆到真核表達(dá)載體pCAGGS中，置于雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的調(diào)控之下，構(gòu)建成可用作DNA疫苗的NDVF和NDVHN基因表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)過(guò)酶切、測(cè)序分析篩選鑒定出含有F、HN基因的重組質(zhì)粒，分別命名為pCAGGS-F和pCAGGS-HN。然后，將用質(zhì)粒純化試劑盒

3、純化后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，用間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明該表達(dá)載體可以表達(dá)F和HN基因。 在國(guó)內(nèi)首次應(yīng)用構(gòu)建的DNA疫苗對(duì)雞胚進(jìn)行免疫，以測(cè)試其安全性(孵化率為100％，6/6)，為后期進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 為了檢測(cè)這些質(zhì)粒是否可以誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫，將21日齡SPF雞分作8組并且每只雞帶有翅標(biāo)，分別肌注接種不同劑量和組合的重組質(zhì)粒、載體質(zhì)粒pCAGGS以及生理鹽水。在免疫實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)

4、用了外科手術(shù)中浸潤(rùn)麻醉的方式給雛雞免疫。具體分組為，pCAGGS-F100μg、pCAGGS-F50μg、pCAGGS-HN100μg、pCAGGS-HN50μg、pCAGGS-F50μg+pCAGGS-HN50μg、pCAGGS-F25μg+pCAGGS-HN25μg、pCAGGS和生理鹽水組，其中pCAGGS-F25μg+pCAGGS-HN25μg組免疫方式為胸肌單點(diǎn)(肌肉和皮下混合)，一免28天后進(jìn)行二免，二免后第四周，所有雞都用

5、0.2ml103EID50的NDVF48E9株攻毒。免疫后及攻毒后每周無(wú)菌采集血清。結(jié)果pCAGGS-F25μg+pCAGGS-HN25μg免疫組的保護(hù)率達(dá)80％(4/5)。根據(jù)第一次所得數(shù)據(jù)，我們對(duì)pCAGGS-F25μg+pCAGGS-HN25μg組加大樣本數(shù)目重新作免疫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果攻毒保護(hù)率pCAGGS-F25μg+pCAGGS-HN25μg組達(dá)到60％(6/10)。表明我們構(gòu)建的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并對(duì)同型N