水禽源新城疫病毒經(jīng)雞傳代后HN蛋白變異的研究.pdf

1、新城疫(ND)是一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞和火雞，亦可感染其它禽類、鳥類和人。國(guó)際獸醫(yī)局 (Office Intemation des Epizooties,OIE)將其與高致病性禽流感同列為危害養(yǎng)禽業(yè)的必須報(bào)告的疫病，因此世界各國(guó)對(duì)本病的發(fā)生和流行均高度重視，在許多發(fā)達(dá)國(guó)家已消滅了本病。新城疫病毒(NDV)只有一種血清型，但不同毒株之間的毒力和致病性差異很大。在世界上曾有過三次大流行，其中兩次源于鸚鵡和鴿，其它禽類由來(lái)的N

2、DV在易感動(dòng)物雞體中連續(xù)傳代后毒力增強(qiáng)的可能性很高。我們?cè)谇捌谘芯抗ぷ髦羞M(jìn)行了NDV無(wú)毒株在雞體內(nèi)傳代的工作，即將從野生水禽的新鮮糞便中分離得到的無(wú)毒株 Goose/Alaska/415/91經(jīng)9代次的雛雞氣囊接種傳代(9a)和5代次雛雞腦內(nèi)接種傳代(5b)，分析每次傳代后分離株的毒力和分子結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明無(wú)毒株演變成了強(qiáng)毒株。F蛋白的基因序列分析結(jié)果表明，原代病毒無(wú)毒株的F蛋白裂解部位112-117位氨基酸序列具有典型的弱毒株模式，

3、即ERQER-L，而經(jīng)過14次的傳代則演化成典型的強(qiáng)毒特征，即KRQKR-F。 最近的研究表明：HN基因也被認(rèn)為在NDV感染過程中起著重要的作用。在根據(jù)NDV基因的核苷酸和氨基酸序列對(duì)NDV分離株進(jìn)行致病性分類時(shí)發(fā)現(xiàn)HN和F基因的變異具有很強(qiáng)的正相關(guān)性。在我們的前期研究工作中重點(diǎn)是放在原代病毒和繼代病毒的F蛋白裂解位點(diǎn)的突變株與致病性演化的關(guān)系上，結(jié)果表明：病毒在逐漸獲得致病性的同時(shí)，F(xiàn)蛋白基因發(fā)生著相應(yīng)的變異。而HN基因的變異

4、與NDV致病性的關(guān)系以及HN蛋白的變異規(guī)律正是本實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)以原代病毒及其繼代共15代次病毒為研究材料，進(jìn)行部分生物學(xué)活性的檢測(cè)，針對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的15個(gè)NDVHN全基因的克隆進(jìn)行測(cè)序與氨基酸序列的分析，研究HN基因的變異規(guī)律，對(duì)于NDV的致病性分子基礎(chǔ)提出新的理論依據(jù)。在實(shí)驗(yàn)中將15代NDV分離株分別接種雞胚尿囊液進(jìn)行增殖病毒，提取病毒基因組總RNA，進(jìn)行RT-PCR．?dāng)U增HN基因，克隆入pGEM-T載體后，經(jīng)藍(lán)白斑篩

5、選，酶切鑒定，陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。經(jīng)過序列比對(duì)分析15代分離株的HN基因發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過在氣囊傳兩代后，白2a(氣囊傳代2次)代起HN蛋白1717位堿基G突變?yōu)門，導(dǎo)致終止密碼子由<'1864>TAA<'1886>提前至<'1717>TAG<'1719>，這使得HN蛋白從616個(gè)氨基酸(aa)縮減為572aa，即少了一個(gè)44aa的尾，且一直保持到9a5b(氣囊傳代9次，再在腦內(nèi)傳代5次)代病毒。HN蛋白中糖基化位點(diǎn)、參與蛋白二聚體形成的半胱