雞新城疫病毒ND-xx08株分離鑒定及F、HN基因的克隆與分析.pdf

1、雞新城疫(Newcastle Disease， ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus， NDV)引起禽的一種高度接觸性、急性敗血性傳染病。新城疫是威脅世界養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)歸為列表疫病。新城疫病毒幾乎可感染全部鳥類，并可隨侯鳥的遷徙而廣泛傳播，NDV屬于副黏病毒科、副黏病毒亞科的腮腺炎病毒屬，單股負(fù)鏈RNA病毒。我國(guó)長(zhǎng)期以來普遍開展了以接種疫苗為主的新城疫綜合防制措施，很好

2、控制了ND的暴發(fā)，但近年來ND的流行又出現(xiàn)了新的特點(diǎn)：非典型新城疫日益增多，甚至高抗體雞群也發(fā)生該病，這些流行特點(diǎn)很可能是由變異或超強(qiáng)毒株引起。近年來鵝源病毒新城疫變異株的出現(xiàn)使人們對(duì)于非典型新城疫發(fā)病原因的尤為感興趣。本研究在2008年從新鄉(xiāng)某雞場(chǎng)不表現(xiàn)典型ND癥狀且高抗體蛋雞中分離到的一株新城疫野毒(NDV ND-xx08株)，在對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)上，擴(kuò)增出其F和HN基因，并做了免疫保護(hù)試驗(yàn)，為探討新城疫病毒是否發(fā)生變異和

3、ND預(yù)防提供理論依據(jù)，為河南省NDV分子流行病學(xué)研究提供有益參考，豐富了我國(guó)ND分子流行病學(xué)特征，為制定控制ND方法提供重要依據(jù)。首先對(duì)NDV ND-xx08株進(jìn)行了一系列生物學(xué)特性研究。SPF雞胚接種培養(yǎng)后，經(jīng)過試驗(yàn)鑒定，該分離株具有血凝性，且可被ND標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所抑制和中和，不能被禽流感(H5，H9)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和EDS-76標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所抑制，因此該分離株為新城疫病毒。該病毒的最小致死量病毒致死雞胚的平均時(shí)間(MDT)為50h;1

4、日齡SPF雞腦內(nèi)接種分離病毒致病指數(shù)(ICPI)為1.71;6周齡SPF雞靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)為2.38；由此NDV ND-xx08株確定屬于NDV強(qiáng)毒型。其次分別設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，Trizol法提取了其RNA，RT-PCR擴(kuò)增出NDV ND-xx08株F基因和HN基因的全基因序列，并分別對(duì)兩條基因的核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定和分析，并對(duì)氨基酸序列進(jìn)行了分析。用DNAStar軟件對(duì)本研究毒株與國(guó)內(nèi)外發(fā)表的一些有代表性的46株參考毒株的ND

5、V F基因47nt-420nt區(qū)域進(jìn)行同源性比較，繪制了基因進(jìn)化樹，分析其遺傳變異關(guān)系。經(jīng)測(cè)定NDV ND-xx08毒株的F基因開放性閱讀框架全長(zhǎng)1662bp，共編碼553個(gè)氨基酸，F(xiàn)蛋白的裂解位點(diǎn)為112R-R-Q-K-R-F117。系統(tǒng)發(fā)育分析得出該分離株屬于基因Ⅶe型，將其與國(guó)內(nèi)外發(fā)表的部分新城疫病毒毒株之間F基因核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比較，其核苷酸序列的同源性在82.7％-97.8%之間，氨基酸同源性在87.5%-97.7%之間

6、，與F48E9株的氨基酸同源性為91.5%，與Lasota，Clone30和V4株的同源性分別為88.1%，88.6%和88.3%。從分子水平上說明NDV ND-xx08株為發(fā)生了一定程度變異的新城疫強(qiáng)毒株。NDV ND-xx08毒株的HN基因開放性閱讀框架全長(zhǎng)1716bp，編碼571個(gè)氨基酸，屬于C群。它與其他24株的HN基因核苷酸序列同源性在80%-98.4%。它與北京毒株(SRZ03)和江蘇毒株（zj1）同源性較高，分別經(jīng)測(cè)定為9

7、8.1%和98.4%。從基因進(jìn)化樹來看，該毒株與北京和江蘇所分離的毒株同源性較近，基本上屬于同一基因群；與Lasota和Clone30等疫苗株的同源性較遠(yuǎn)，屬不同的基因群。ND-xx08株HN蛋白氨基酸序列與其他24株同源性在87.2%-98.2%，與Lasota和Clone30的同源性分別為88.2%和89.3%，同源性較低。最后用該毒株做了免疫保護(hù)性試驗(yàn)，分別將NDV ND-xx08株尿囊液稀釋10、100、1000倍，將原尿囊液和