鴨新城疫病毒的分離鑒定及單克隆抗體的制備與應用.pdf

1、鴨新城疫，也稱為鴨副粘病毒病(Duckparamyxovirusdisease，DPMV)是由禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-Ⅰ)引起的以腹瀉、癱瘓、神經(jīng)癥狀和消化道、呼吸道粘膜充血、出血或潰瘍等為主要特征的一種急性、高度接觸性傳染病。不同日齡的鴨均易感，且日齡越小，易感性越高，發(fā)病率和死亡率也越高。以往水禽對APMV-Ⅰ具有較強的抵抗力，儀表現(xiàn)為帶毒，即使強毒感染也不致病(殷震等，1997；Losovacetal.，1988)。但近年來，A

2、PMV-Ⅰ對鵝、鴨等水禽也產(chǎn)生了較強的致病作用[4-9]。是危害我國水禽業(yè)的一大重要疫病
　　 建立和完善鴨群體內(nèi)DPMV的檢測手段，是對該病進行流行病學調(diào)查以及預防控制的關鍵。DPMV各毒株之間毒力差異較大，采用常規(guī)的血凝抑制試驗不易檢測出其抗原結(jié)構的差異。單克隆抗體能夠識別刺激宿主產(chǎn)生免疫反應的抗原表位，具有針對單個抗原決定簇的特異性，可以檢測不同DPMV毒株間抗原表位結(jié)構的差異。制備抗鴨副粘病毒(DPMV)的特異性單克隆抗

3、體，可為禽副粘病毒抗原性分析、建立快速檢測試劑盒和免疫層析膠體金試紙條的研制奠定基礎。建立ELISA檢測方法和研制膠體會免疫層析試紙條，便于DPMV臨床大量樣品的快速診斷與現(xiàn)場檢測樣品的快速篩查。
　　 一：鴨新城疫病毒的分離及其F基因的分子特征
　　 從江蘇省某鴨群中分離到1株病毒，經(jīng)血清學試驗和中和試驗鑒定為鴨新城疫病毒，命名為JS0920株。生物學特性測定：半數(shù)致死量(ELD50)為10-5.3，最小致死量平均死亡

4、時間(MDT)為47.7h，1日齡SPF雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)為1.875，6周齡雞靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)為2.7。動物回歸試驗：鴨的發(fā)病率為70％，死亡率為40％；雞的發(fā)病率和死亡率均為100％。用RT-PCR方法擴增該分離毒株的F基因，序列分析表明，JS0920株與標準強毒株F48E9的核苷酸序列和氨基酸序列同源性最高，分別為99.2％和99.5％，其多肽裂解位點為112R-R-Q-R-R-F117，具有高致病性鴨新城

5、疫病毒毒株的分子特征：系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，JS0920株與F48E9株的親緣關系最近，為基因Ⅸ型。
　　 二：鴨新城疫病毒單克隆抗體的制備
　　 采用蔗糖密度梯度離心法提純DPMV，用甲醛滅活，免疫BALB/c小鼠，制備免疫脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接ELISA和間接免疫熒光試驗(IFA)方法篩選到4株能穩(wěn)定分泌抗DPMV抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為2D7、2F6、3E4和3G2。免疫球蛋白亞類測定結(jié)果顯

6、示：2D7的Ig亞類為IgG1，2F6為lgG2b，其余2株為IgM，輕鏈均為k型。其中2D7還具有中和活性。特異性測定結(jié)果顯示四株單抗與NDV、IBV、EDSV-76、IBDV(B87)、AIV(H9N2)及SPF雞胚空白尿囊液均無交叉反應。
　　 三：雙抗體夾心ELISA方法的建立及免疫膠體金層析試紙條的研制
　　 采用改良過碘酸鈉標記法，用HRP標記純化的單克隆抗體2D7，制備2D7-HRP酶標抗體復合物作為檢測抗

7、體，純化的單抗2F6作為捕獲抗體，建立雙抗體夾心ELISA檢測方法，可檢測到HA價為24的DPMV液。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，用純化的單克隆抗體2D7標記，制備金標抗體玻璃纖維素膜；將純化的2F6固定于硝酸纖維素膜(NC)上作為捕獲抗體；組裝成雙抗央心法DPMV膠體金免疫層析檢測試紙條。用該試紙條可特異檢測DPMV，最低可檢測血凝滴度為25的病毒量，在1～5min內(nèi)可得出檢測結(jié)果，特異性強，便于DPMV的臨床快速診斷與現(xiàn)場檢測樣