表達雞新城疫病毒HN基因重組雞痘病毒活疫苗的臨床前研究.pdf

1、雞新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的家禽最嚴重的傳染病之一。NDV的病毒囊膜含有2個主要的糖蛋白,即融合蛋白(F)和血凝素—神經氨酸酶蛋白(HN),它們都被用于重組雞痘病毒疫苗的研究。本研究從我們實驗室已構建的單表達、共表達新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)和血凝素—神經氨酸酶蛋白(HN)基因的重組雞痘病毒中篩選一個作為疫苗候選株,進一步完善實驗室試驗,并在GMP條件下完成中間試制,為新城疫重組雞痘病毒活疫苗順利進入臨床試驗打

2、好了基礎。
　　 1.單表達和共表達NDV F和HN基因重組雞痘病毒活疫苗的免疫效力比較試驗
　　 為評價母源抗體對抗新城疫(ND)重組雞痘病毒(rFPV)活疫苗免疫效力的影響,本研究用單表達、共表達NDV基因Ⅶ型病毒ZJ1株F、HN基因的rFPV活疫苗rFPV-12L,SF、rFPV-12LSHN、rFPV-12LSFHN和油乳劑滅活疫苗分別免疫14日齡商品蛋雞,重組雞痘病毒疫苗的免疫劑量均為2×104PFU,免疫后2

3、1d分別用106ELD50NDV不同強毒株攻毒。其中F48E8株攻毒的免疫保護率分別為30.3％、73.2％、41.1％、89.3％;而ZJ1株攻毒的免疫保護率分別為35.8％、67.9％、78.6％、100％。用表達雞IL-2基因的重組雞痘病毒rFPV-12L,SIL-2與rFPV-12LSHN聯(lián)合免疫沒有提高rFPV-12LSHN疫苗的免疫保護力。試驗結果表明,單表達NDV HN基因的重組雞痘病毒rFPV-12LSHN可作為ND活疫

4、苗候選株,為ND重組雞痘病毒活疫苗的進一步應用性開發(fā)奠定了基礎。
　　 2.表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒的部分生物學特性研究
　　 為了評價轉基因對雞痘病毒(FPV)生物學特性的影響,通過電鏡觀察重組雞痘病毒(rFPV)感染的雞胚成纖維細胞(CEF),結果表明在FPV中插入NDV血凝素—神經氨酸酶蛋白(HN)基因(rFPV-12LSHN)后,不改變rFPV的形態(tài)、病毒成熟過程。rFPV-12LSHN與FPV在CE

5、F上的產量無顯著差異。rFPV-12LSHN接種11日齡雞胚,在尿囊膜(CAM)上觀察到典型痘斑或水腫,雞胚最小感染量≤100PFU。免疫熒光試驗證明,rFPV-12LSHN在CEF上傳代能穩(wěn)定表達NDV HN抗原。rFPV(103PFU/羽)接種SPF雞快速誘導NDV HI抗體應答,免疫3周后完全保護NDV強毒攻擊。
　　 3.表達新城疫HN基因的重組雞痘病毒活疫苗的免疫持續(xù)期和加強免疫研究
　　 為了評價表達新城疫病

6、毒(NDV)血凝素—神經氨酸酶(HN)基因的重組雞痘病毒(rFPV-12LSHN)活疫苗的免疫持續(xù)期和加強免疫對疫苗免疫效力的影響。用rFPV-12LSHN活疫苗免疫14日齡SPF雞,103PFU/羽,7 d即可檢測到NDV HI抗體應答,對NDV強毒F48E8株攻毒保護率達100％。一次免疫18周后,對NDV強毒攻擊依然提供完全保護。雞痘病毒(FPV)疫苗免疫4周,再接種rFPV-12LSHN活疫苗,攻毒保護率降低至50％。相反,rF

7、PV-12LSHN免疫4周,隨后二次免疫可顯著提高對NDV的體液免疫應答水平(P＜0.01),對NDV強毒攻擊的保護率沒有影響。結果表明,表達NDV HN基因的重組雞痘病毒(rFPV-12LSHN)活疫苗,能夠快速建立堅強免疫力,免疫持續(xù)期至少可達18周,rFPV-12LSHN的二次免疫可以提高疫苗的免疫力。
　　 4.重組雞痘病毒活疫苗X-gal染色空斑計數法的建立
　　 建立了一種簡易的攜帶LacZ基因重組雞痘病毒(

8、rFPV)活疫苗的X-gal染色空斑計數法。rFPV接種次代雞胚成纖維細胞(CEF)72h后,加2mL/L戊二醛固定液室溫固定15min,再加500ug/mL X-gal染色液37℃過夜,倒置顯微鏡下直接計數藍染空斑。染色空斑計數法的空斑數是不染色直接計數法的1.6-3.3倍。該方法在重組雞痘病毒活疫苗研究及其工業(yè)化生產檢驗中具有較大的應用價值。
　　 5.雞新城疫重組雞痘病毒活疫苗的中試生產
　　 為了給臨床試驗提供疫

9、苗,在GMP條件下進行了雞新城疫重組雞痘病毒活疫苗(rFPV-ND-HN)的中試生產。CEF作為制苗材料,培養(yǎng)于10000ml轉瓶,按0.2PFU/細胞接種毒種rFPV-12LSHN,37℃12轉/h旋轉培養(yǎng),待細胞病變達到80％,收獲感染細胞,加適量的5％蔗糖—脫脂奶粉,隨后凍干。共生產了5批rFPV-ND-HN凍干疫苗,質量指標全部達到標準要求。
　　 總結
　　 1.篩選出單表達NDV HN基因的重組雞痘病毒(rF

10、PV-12LSHN)作為疫苗候選株。
　　 2.rFPV-12LSHN與親本毒株FPV-LP在CEF細胞內的病毒形態(tài)、繁殖方式以及病毒產量沒有明顯變化。
　　 3.rFPV-12LSHN活疫苗,能夠快速建立堅強免疫力,免疫持續(xù)期至少可達18周。
　　 4.rFPV-12LSHN的二次免疫可以顯著提高疫苗的NDV HI抗體應答。
　　 5.建立了一種簡易、快速、敏感的重組雞痘病毒活疫苗的X-gal染色空斑計