雞痘病毒基因組中反轉錄病毒序列整合的研究及重組雞痘病毒的構建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、為研究我國雞痘病毒疫苗毒和野毒分離株中禽網狀內皮增生癥病毒序列(reticuloendotheliosis virus,REV) 的整合情況,本文分離和收集了一些整合有REV的痘病毒疫苗毒株及野毒株,對這種自然重組現(xiàn)象在病毒變異和演化上的普遍意義和流行病學意義做了一些探索,并以此為基礎,運用DNA重組技術構建了表達綠色熒光蛋白(GFP)的重組雞痘病毒GFP-FPV病毒,為制備純化的痘病毒疫苗奠定基礎。 1 國內外雞痘疫苗毒基因組

2、中REV序列整合的研究本試驗收集國內外10家廠家生產的10株雞痘弱毒疫苗和282E4株,先后在SPF雞胚和雞胚成纖維細胞(CEF)上傳代增殖,用REV單抗進行間接免疫熒光試驗(indirect immuo-fluoresence assay,IFA),并提取病毒DNA,根據(jù)已發(fā)表的FPV整合REV前病毒基因組序列的位點,設計合成了1對分別位于FPV基因組中201和2030RF’的引物,經PCR擴增,發(fā)現(xiàn)不同的FPV疫苗株可得到400 b

3、p、700 bp、1400bp、1700bp、2000bp、2500bp、5000bp、8000bp等大小不等的一個或數(shù)個片段。將1400bp、1700bp的擴增片段克隆、測序和序列分析,發(fā)現(xiàn)這些擴增片斷均為FPV與REV的重組產物,整合的REV序列隨擴增片斷不同而異,不同疫苗株整合的REV前病毒基因序列大小也不同,這些整合的REV序列大小為LTR的191bp或504bp等,與國外已經測定的痘病毒毒株的同源性不僅高達98-99%,而且整

4、合的位點也完全一致;與國外REV毒株APC566、713和SNV的同源性分別為:99.6%、98.0%和87.3%,與我國REV分離株HA9901的同源性為83.6%。進一步分析表明REV與FPV之間的整合模式至少有4種。 2 雞痘野毒基因組中整合REV全序列的測定和分析根據(jù)已發(fā)表的REV和FPV序列設計9對引物,從分離的8株雞痘病毒野毒株中挑選安丘株和平度株這2株熒光抗體試驗呈現(xiàn)陽性的痘病毒,擴增其整合的REV’前病毒全序列,并與己發(fā)

5、表的REV毒株進行比較,發(fā)現(xiàn)安丘株全長7941bp,在痘病毒基因組上的起始位點為LTR的第30位堿基,3’端LTR在痘病毒基因組上的終止位點為LTR的第213位堿基,相對于全長8221bp的REV前病毒(AF246698.2),3’端的LTR長度明顯縮短。平度株比安丘株少3個堿基,并有8個堿基的差異。安丘株與國外的毒株DQ387450.1(APC-566)、AF246698.2、AY842951.1(HA9901)、DQ003591.1

6、(SNV)及REV序列高度同源,為97—99%。進化樹比較表明安丘株和平度株很可能是目前流行的痘病毒野毒株。 3 人工構建不含REV的重組雞痘疫苗株利用整合有REV IXR的痘病毒282E4株作為原始病毒,選取其REV穩(wěn)定整合的痘病毒201和203閱讀框做同源重組區(qū)域,以增強型綠色熒光蛋白(Enhancedgreen fluorescent protein) 做為報告基因,與痘病毒啟動子p7.5一起構建了osk-p7.5-EGF

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