表達ILTV gB及gD主要抗原表位基因和雞IgY重鏈恒定區(qū)基因重組雞痘病毒免疫效力的研究.pdf

1、南京農業(yè)大學博士學位論文表達ILTVgB及gD主要抗原表位基因和雞IgY重鏈恒定區(qū)基因重組雞痘病毒免疫效力的研究姓名：劉文波申請學位級別：博士專業(yè)：預防獸醫(yī)學指導教師：陳溥言20051201表達IuVgB及gD主要抗原表位基因和雞lgY重鏈恒定區(qū)肇因重組鴆瘟病毒免疫效力的研究pMDl8T載體中進行序列測定。結果表明，ILTVgE基因包括1個1500bp的完整開放閱讀框架，可編碼499個氨基酸組成的多肽。將ILTV煙臺株的gE基因和gE蛋

2、白分別與ILTv美國標準攻毒毒株和中國王崗株、BHVl、EHV1、FHVl、HHv2、HHV3、HVT、MDV1、MDV2和PRV的gE基因和gE蛋白比較，發(fā)現它們之間gE基因的核苷酸和gE蛋白氨基酸的同源性分別在997％～119％和994％～15％之間。表明不同ILTV毒株之間，gE基因還是比較保守的，但不同疤疹病毒之間，gE基因的同源性比較低。氨基酸序列分析表明，ILTVgE蛋白屬典型的I型膜蛋白，具有與其他Ⅱ皰疹病毒gE蛋白相似的

3、排列與結構。同時，在IuV旺蛋白相應位置還發(fā)現了其他Q皰疹病毒薛蛋白均有的5個保守的Cys殘基及2個保守的特征性氨基酸殘基基序(YXXL)。這一切表明，ILTvgE蛋白可能和其他旺皰疹病毒gE蛋白具有一些相似的生物學功能。3目的片段的選取及重組雞痘病毒轉移載體pEFgBgD和pEF—gBgD—lgY的構建以傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)3哐I臺株基因組DNA為模板，根據已發(fā)表的ILTVSA2株基因序列設計并合成2對引物，分別擴增其gB和

4、gD的主要抗原表位基因，同時人工合成IgY重鏈恒定區(qū)第900～1400基因。在gB上游引物5’端添加ATOGCG，gD上游引物5’端設計一個9個氨基酸的linker(GSLAGALGL一)，在合成的IgY重鏈恒定區(qū)基因3’端添加1’AA，使gB及gD主要抗原表位基因與IgY重鏈恒定區(qū)基因／94i后形成一個完整的閱讀框架。將gB和gD片段分別亞克隆到pBluescriptIISK()中，得到重組質粒pSK—gBgD。同時利用Primer5

5、0軟件設計并合成1對引物，擴增串聯(lián)的gB和gD主要抗原表位基因片段。在卵gD下游引物中添加TAA，以使gB—gD基因片段形成一個完整的閱讀框架，然后再將從重組質粒pSKgB—gD酶切回收得到的gB—gD基因片段和人工合成的IgY重鏈恒定區(qū)片段及PCR擴增得到的gB—gD基因片段分別亞克隆到雞痘病毒轉移質粒載體pEFgptl2s中。經酶切分析和PCR鑒定，表明已成功構建了重組雞痘病毒轉移載體pEFgB—gD和pEF—gB—gD—IgY，為

6、進一步在細胞中轉染并獲得表達傳染性喉氣管炎病毒班及gD主要抗原表位基因和雞IgY重鏈恒定區(qū)基因的重組雞痘病毒奠定了基礎。4目的片段在重組雞痘病毒中的表達及重組病毒生物學特性的研究1ffl脂質體法，將構建好的重組雞痘病毒轉移載體pEF—gB—gD和pEF—gB—gD—IgY轉染已感染雞痘病毒282E4疫苗株2h的次代雞胚戍纖維細胞，待出現明顯病變后收毒，用藥物篩選培養(yǎng)基(MXHAT)在24孔板上進行連續(xù)篩選純化，得到重組病毒rFPVgBg