穩(wěn)定表達雞恒定鏈基因的P815細胞株的建立及鑒定.pdf

1、恒定鏈（invariant chain,Ii）是主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子的伴侶蛋白之一，具有輔助其遞呈外源性抗原的功能。近期研究表明Ii還可作為細胞因子MIF的受體介導(dǎo)炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生。人和哺乳動物Ii研究較為深入，禽類起步較晚，為了對雞Ii的結(jié)構(gòu)與功能進行深入研究，我們擬建立穩(wěn)定表達Ii的P815細胞株。首先以實驗室保存的PMD18-T/Ii重組

2、質(zhì)粒為模板，根據(jù)其中雞Ii基因的序列，設(shè)計一對引物，通過PCR獲得了雞Ii鏈全長基因片段。然后將其插入到真核熒光表達載體pDsRed2-N1，pEGFP-C1構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pDsRed2-N1/Ii，pEGFP-C1/Ii，經(jīng)過卡那霉素抗性篩選，EcoR I、Sal I雙酶切，PCR初步鑒定正確后，由上海生工進一步測序鑒定。通過XfectTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將鑒定正確的重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到COS7細胞，觀察GFP-Ii,RFP-Ii表達

3、情況，發(fā)現(xiàn)熒光主要分布于細胞內(nèi)膜系統(tǒng)。之后我們對人、牛、雞、鵪鶉的恒定鏈進行了一系列生物信息學分析，包括序列比對、進化樹的繪制、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測和細胞內(nèi)定位特性的預(yù)測。發(fā)現(xiàn)此4個物種的Ii鏈同源性達到61.69％，其中人與牛同為哺乳動物同源性高達81.3％，雞與鵪鶉同為禽類，同源性高達85.6％。進化樹也表現(xiàn)出同樣的規(guī)律，人與牛，雞與鵪鶉分別表現(xiàn)出更近的進化關(guān)系。在對該4個物種Ii蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬后，發(fā)現(xiàn)它們具有高度的結(jié)構(gòu)相似性，因此我們

4、推測它們的功能也是極為類似的，而經(jīng)過預(yù)測我們發(fā)現(xiàn)它們的細胞內(nèi)定位特性也確實十分相似。最后我們將pEGFP-C1/Ii轉(zhuǎn)染到P815細胞，通過G418壓力篩選獲得了抗3mg/ml G418的P815細胞株，RT-PCR結(jié)果表明該細胞株具有穩(wěn)定表達Ii的能力。通過對P815-GFP-Ii的熒光顯微鏡觀察我們發(fā)現(xiàn)GFP-Ii主要定位于細胞內(nèi)膜系統(tǒng)，在前人研究的基礎(chǔ)上，聯(lián)系Ii細胞內(nèi)定位特性預(yù)測結(jié)果，我們推測Ii在細胞核定位時主要分布與核膜上。