細胞膜上穩(wěn)定表達融合蛋白crtvgpcra549細胞株的建立

1、<p>　　細胞膜上穩(wěn)定表達融合蛋白CRT/vGPCR的A549細胞株的建立</p><p>　　秦 燁1，韓 鈺1，任玉珊1,王艷林1，2,*，</p><p>　　（1 三峽大學分子生物學研究所，2三峽大學醫(yī)學院，湖北 宜昌 443002）</p><p>　　[摘要] 目的： 將人鈣網(wǎng)蛋白（CRT）基因與病毒G蛋白偶聯(lián)受體（vGPCR）基因進行基

2、因重組，用此重組基因建立細胞膜上穩(wěn)定高表達CRT/vGPCR融合蛋白的人肺癌A549細胞株。方法：從pSG5-vGPCR質(zhì)粒中獲得全長vGPCR基因片段并與CRT全長編碼序列的3`端連接形成融合基因，然后將融合基因克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)中。用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人A549肺癌細胞，通過G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A549細胞株，用RT-PCR檢測重組融合基因的表達，用細胞免疫熒光分析鑒定融合蛋白的表達及其在細胞膜上的定位。結(jié)果：成

3、功獲得重組融合質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR，經(jīng)DNA序列測定證實融合基因兩閱讀框（ORF）對接無誤。將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞后，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CRT/vGPCR的A549細胞株，融合基因在A549細胞中表達并定位到細胞膜上。結(jié)論：通過與CRT基因融合重組，具有膜定位能力的vGPCR能將CRT蛋白高效包被到腫瘤細胞膜上。該項技術在CRT介導的腫瘤免疫治療中具有重要的潛在應用價值。</p><p>

4、;　　[關鍵詞] 融合基因，CRT，vGPCR，腫瘤細胞</p><p>　　[中圖分類號] Q784;Q785;Q786 [文獻標識碼] B</p><p>　　基金項目：國家自然科學基金（30973445）；三峽大學研究生創(chuàng)新基金（200934），作者簡介：秦燁（1985-），女，漢族，湖北宜昌人，碩士研究生, Tel: 13774197116；E-mail:

5、ycqinye@yahoo.cn；聯(lián)系作者：王艷林, E-mail: fzswangyl@ctgu.edu.cn.</p><p>　　Establishment of A549 Cell Line with Stable Expression </p><p>　　of CRT/vGPCR Recombinant Protein on Cell Membrane</p>&

6、lt;p>　　QIN Ye1, HAN Yu 1, REN Yu-shan1, WANG Yan-lin1,2 </p><p>　　Three Gorge University Institute of Molecular Biology , 2.Three Gorge University Medical College，Hubei, Yichang, 443002, China</p>

7、<p>　　[Abstract] Objective: To make a CRT recombinant gene with virus G-protein couple receptor (vGPCR) and, using this fusion gene, to establish A549 cell line with stable expression of CRT/vGPCR recombinant protei

8、n on the cell membrane. Methods: CRT-encoding sequence was amplified by PCR from pET-28a/CRT and ligated to the whole-length vGPCR-encoding sequence. The fusion gene (CRT/vGPCR) was then cloned into eukaryotic expression

9、 plasmid pcDNA3.1(+) and transfected into A549 cell line by Lipofectami</p><p>　　Key words: recombinant gene, CRT, vGPCR, tumor cells</p><p>　　鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin，CRT）是主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+結(jié)合蛋白[1]。某些凋亡刺激在

10、誘導特定腫瘤細胞發(fā)生凋亡時，會導致細胞內(nèi)的CRT向細胞膜轉(zhuǎn)移并發(fā)生簇集，這種表面有大量CRT包被的凋亡腫瘤細胞在機體內(nèi)可被樹突狀細胞（DC細胞）識別和吞噬，進入DC細胞后，腫瘤抗原被加工和提呈，由此激發(fā)機體抗腫瘤的特異性免疫應答，提示CRT在介導腫瘤免疫預防與治療中的潛在應用價值[2,3]。為研發(fā)一種在所有腫瘤細胞都能有效地進行CRT細胞膜包被的實驗技術，本研究中我們將CRT基因與病毒G蛋白偶聯(lián)受體（vGPCR）基因[4]進行基因重組融

11、合，重組基因轉(zhuǎn)染人肺癌A549細胞后，可望翻譯出融合蛋白CRT/vGPCR，由于融合蛋白中的vGPCR具有強力的膜定位能力，可將CRT攜帶到腫瘤細胞膜表面，由此建立能在細胞膜上穩(wěn)定高表達CRT/vGPCR融合蛋白的細胞株。</p><p><b>　　1 材料和方法</b></p><p>　　1.1 材料 人肺癌細胞株A549購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌

12、株E.coli DH5α、質(zhì)粒pcDNA3.1(+)、pET15b/CRT、pSG5/vGPCR由本研究所保存。限制性核酸內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTP、RNase-Free DNaseⅠ、RT-PCR及PCR試劑盒由Fermentas公司提供,DNA純化試劑盒購自Omega公司, 細胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000TM由Invitrogen公司提供。兔抗人CRT多克隆抗體購于Stressgen公

13、司，羅丹明標記的山羊抗兔IgG購于武漢興華基因生物科技有限公司，RPMI-1640細胞培養(yǎng)基以及其它化學試劑由Sigma等公司提供。EPICS XL-4流式細胞儀為Beckman Coulte公司產(chǎn)品，ECLIPSE TE2000-S倒置熒光顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品。PCR引物合成及DNA測序均由上海生工公司完成。</p><p><b>　　1.2 方法</b></p>&l

14、t;p>　　1.2.1 PCR擴增人CRT基因 以質(zhì)粒pET15b/CRT為模板，用PCR技術擴增出人CRT全長編碼序列(不含有終止密碼子)，產(chǎn)物長度為1254 bp。所用PCR引物的5′端和3′端分別引入HindⅢ和EcoRI限制性酶切位點，以利于隨后的克隆操作。引物的DNA序列為：上游引物5′ATTCAAGCTTATGCTGCTATCCGTGCCGCTG；下游引物5′TTATGAATTCCAGCTCGTCCTTGGCCTGG

15、C</p><p>　　C。PCR在50μL的總體積中進行,以500倍稀釋的質(zhì)粒pET15b/CRT為模板, PCR擴增條件為:在94℃變性5 min后開始循環(huán),然后94℃變性30 s,55℃退火30 s, 72℃延伸90 s, 30個循環(huán)后,再于72℃延伸5 min結(jié)束擴增，4℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　1.2.2 PCR擴增vGPCR基因 以質(zhì)粒pSG5/vGPCR為模板，用P

16、CR技術擴增vGPCR全長編碼序列,長度為1029 bp, 含胞外區(qū)、七次跨膜區(qū)和胞內(nèi)功能區(qū)。在PCR引物的5′端和3′端分別引入EcoRI和XhoI限制性酶切位點，以利于隨后的克隆操作。引物DNA序列為：上游引物： 5′GAGTGAATTCATGGCGGCCGAGGATTTCCTA；下游引物： 5′AATACTCGAGCTACGTGGTGGCGC</p><p>　　CGGACAT。PCR在50μL的總體積中進

17、行,以500倍稀釋的質(zhì)粒pSG5/vGPCR為模板, PCR擴增條件為:在94℃變性5 min后開始循環(huán),然后94℃變性30 s,55℃退火30 s, 72℃延伸90 s, 30個循環(huán)后,再于72℃延伸5 min結(jié)束擴增，4℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　1.2.3 pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 PCR獲得的CRT DNA片段用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ+EcoRI雙酶切消化，

18、經(jīng)PCR純化試劑盒純化回收。PCR獲得的vGPCR DNA片段用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI+XhoI雙酶切消化后，用T4連接酶將它與純化的CRT酶切片段連接，所得的融合基因再克隆入經(jīng)HindⅢ+XhoI雙酶切消化的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，以堿裂解法從陽性克隆中提取質(zhì)粒,雙酶切及測序鑒定。</p><p>　　1.2.4 CRT/vGPCR基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549細胞系的建立

19、A549細胞用含10%小牛血清的PMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)（37℃，5% CO2），至80%左右的融合度時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR，另取細胞轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1(+)作為對照，具體轉(zhuǎn)染步驟按照將Lipofectamine2000TM轉(zhuǎn)染試劑的說明書進行。轉(zhuǎn)染48h后向培養(yǎng)基中加入G418至終濃度為400μg/ml，待形成單克隆后，挑取單克隆放大培養(yǎng)。收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆，用Trizol試劑法從轉(zhuǎn)染

20、細胞和對照細胞中提取細胞總RNA，以此總RNA為模板，Oligo(dT)為引物，MMLV催化將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 第一鏈，以1µL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板, PCR鑒定CRT-vGPCR融合基因在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。 PCR上游引物位于CRT編碼序列的817 bp處，下游引物位于vGPCR編碼序列的235 bp 處，引物序列為：上游引物：CRT-U 5′AGAGATGGACGGAGAGTGGGA，下游引物:vGPCR-D5′ CCG

21、CGATCGGTGCTTGCAAAA。PCR在50μL的總體積中</p><p>　　1.2.5 細胞免疫熒光法檢測CRT/vGPCR融合蛋白在細胞膜上的表達 棄去RPMI-1640細胞培養(yǎng)基，40g/L多聚甲醛置冰上固定細胞10 min，冰冷的0.1mol/L PBS洗3次，加入1：200稀釋的一抗（兔抗人CRT多克隆抗體）4℃過夜，冰冷的0.1mol/L PBS洗3次，加入1：200稀釋的二抗（羅丹明標記的

22、羊抗兔IgG）置37℃避光進行抗原抗體反應1 h 。0.1mol/L PBS洗3次后加入Hoechst333258(終濃度為0.2g/L)置室溫15 min染細胞核。用倒置熒光顯微鏡觀察，在紅色激發(fā)光下可見羅丹明標記的紅色光，即CRT所在位置，在藍色激發(fā)光下可見藍色光，為細胞核所在位置。試驗中設A549空白對照和pcDNA3.1(+)空載質(zhì)粒對照，并在處理過程中設無一抗組以排除二抗的非特異性吸附。</p><p>

23、;<b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 融合基因CRT/vGPCR真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 以質(zhì)粒pET15b/CRT為模板通過PCR得到人CRT基因全長片段，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳可見一大小約為1254 bp的特異性條帶（圖1）。以pSG5/vGPCR為模板經(jīng)PCR擴增得到全長vGPCR基因片段（vGPCR），所得的PCR產(chǎn)物分別經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳可見

24、大小約為1029 bp的特異性條帶（圖2）。將得到的CRT產(chǎn)物與vGPCR產(chǎn)物連接并克隆到pcDNA3.1(+)真核表達質(zhì)粒中，獲得的pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR重組質(zhì)粒經(jīng)多種酶切后，所得限制性片段與預期結(jié)果一致（圖3）。DNA測序證實融合基因兩閱讀框架（ORF）對接無誤。</p><p>　　圖1 從pET-28a/CRT獲得編碼CRT的PCR產(chǎn)物</p><p>　　M:

25、 1 kb DNA marker; P: CRT 的PCR產(chǎn)物</p><p>　　圖2 從pSG5/vGPCR獲得編碼vGPCR的PCR產(chǎn)物</p><p>　　M: 1 kb DNA marker; P: vGPCR的PCR產(chǎn)物</p><p>　　圖3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR的酶切鑒定</p><p>　　M

26、: 1 kb DNA marker；1: 質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR；2:質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR用HindⅢ和ECoRⅠ消化；3:質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR用ECoRⅠ和XhoⅠ；4:質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR用HindⅢ用XhoⅠ消化</p><p>　　2.2 RT-PCR檢測CRT/vGPCR在mRNA水平上的的表達 用T

27、rizol試劑法從轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR的A549細胞株A549中提取細胞總RNA，以此為模板，Oligo(dT)為引物，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶MMLV催化將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 第一鏈。 再以此cDNA第一鏈為模版，以CRT-U和vGPCR-D為引物進行PCR擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細胞中重組基因高效表達（圖4）。</p><p>　　圖4 RT-PCR鑒定融合基因在mRNA水平的表達</p&g

28、t;<p>　　M：1 kb DNA marker；</p><p>　　1：陰性對照（未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的A549細胞株）</p><p>　　2：表達CRT/vGPCR的A549細胞株</p><p>　　3：陽性對照（模板為500×稀釋的重組質(zhì)粒）</p><p>　　2.3免疫熒光細胞化學技術法檢測CRT/vGPC

29、R融合蛋白在細胞膜上的表達 取CRT/vGPCR融合基因mRNA高表達的細胞株，用細胞免疫熒光的方法檢測融合蛋白在細胞膜上的表達。試驗中以未轉(zhuǎn)染的A549細胞作為空白對照，以轉(zhuǎn)染了空白載體pcDNA3.1(+)的細胞株作為陰性對照，并設不加一抗對照組排除二抗的非特異性吸附。結(jié)果顯示細胞對二抗沒有非特異性吸附，空白對照和陰性對照細胞內(nèi)可見彌散分布于胞質(zhì)中的紅色熒光，即CRT的正常分布。pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后

30、，可見A549 細胞膜上出現(xiàn)大量紅色熒光且均勻分布（圖5），說明通過與CRT基因融合重組，具有膜定位能力的vGPCR可將CRT蛋白高效包被到細胞膜上。</p><p>　　圖5 細胞免疫熒光分析CRT/vGPCR融合蛋白在A549中的表達 </p><p>　　A：未轉(zhuǎn)染的A549細胞株，未加一抗處理；</p><p>　　B：未轉(zhuǎn)染的A549細胞株；<

31、/p><p>　　C：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的A549細胞株；</p><p>　　D：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR的A549細胞株</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　在特定凋亡誘導因子的作用下，部分細胞在發(fā)生凋亡時，部分CRT蛋白分子從細胞內(nèi)快速轉(zhuǎn)移到細胞膜上，

32、這些出現(xiàn)在膜上的CRT是介導凋亡細胞被識別和吞噬的重要信號分子。新近的研究發(fā)現(xiàn)，凋亡腫瘤細胞膜上出現(xiàn)的CRT還可激發(fā)機體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫應答，提示CRT在腫瘤免疫防治中的潛在應用價值[5]。由于CRT的膜轉(zhuǎn)移并非所有凋亡腫瘤細胞的固有特征，因而建立一種能方便有效地將CRT蛋白包被到腫瘤細胞膜表面的實驗方法，將有助于CRT介導的腫瘤免疫治療的研究。本研究中，我們利用基因融合重組技術，將CRT與具有膜定位能力的vGPCR基因融合并克隆至

33、真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中。vGPCR是N端在膜外、C端在膜內(nèi)、含七次跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。融合蛋白中CRT位于vGPCR的N端，即融合蛋白結(jié)合到細胞膜后，CRT部分將面向細胞膜外側(cè)。RT-PCR分析證實，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549細胞后，重組融合基因在細胞內(nèi)能高效表達。用免疫熒光細胞化學技術分析進一步發(fā)現(xiàn)，正常細胞中CRT較均勻分布于胞質(zhì)中，但細胞內(nèi)表達的CRT/vGPCR融合蛋白能大量定位到細胞膜上。綜上所述，本研究中我們通過構(gòu)建CR

34、T-vGPCR融合基因，</p><p><b>　　4.參考文獻</b></p><p>　　[1] Opas M，Dziak E, Fliegel L, et al. Regulation of expression and intracellular distribution of calreticulin, a major calcium binding pr

35、otein of nonmuscle cells[J]. Cell Physiol，1991，149(1)：160–171.</p><p>　　[2] Obeid M, Tesniere A, Ghiringhelli F, et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death[J]. Nat Med, 200

36、7, 13:54–61.</p><p>　　[3] Gardai SJ, McPhillips KA, Frasch SC. Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte[J].Cell, 2005, 123(2

37、):321-334. </p><p>　　[4] Liu C, Sandford G, Guo F and Nicholas J. G protein selectivity determinant specified by a viral chemokine receptor-conserved region in the C tail of the human herpesvirus 8 G protein

38、-coupled receptor. J Virology, 2004, 78(5):2460–2471.</p><p>　　[5] Gomez-Gutierrez JG, Elpek KG, Montes de Oca-Luna R, et al. Vaccination with an adenoviral vector expressing calreticulin-human papillomaviru