細(xì)胞融合與紅細(xì)胞膜滲透性觀察

1、細(xì)胞融合與紅細(xì)胞膜滲透性觀察,一、實(shí)驗(yàn)原理,細(xì)胞融合（cell fusion）又稱(chēng)細(xì)胞雜交（cell hybridization），是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞的現(xiàn)象。細(xì)胞融合術(shù)是細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤學(xué)等研究的一重要手段，也是制備單克隆細(xì)胞株的重要技術(shù)。,在誘導(dǎo)物（如仙臺(tái)病毒，聚乙二醇）作用下，相互融合的細(xì)胞發(fā)生凝集，隨后在質(zhì)膜接觸處發(fā)生質(zhì)膜成份的一系列變化，主要是某些化學(xué)鍵的斷裂與重排，最后打通兩質(zhì)膜，形成雙

2、核或多核細(xì)胞。,細(xì)胞融合,病毒是最早采用的融合劑。常用于誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的病毒有仙臺(tái)病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒等，其中仙臺(tái)病毒最常用。用作融合劑的病毒必須事先用紫外線或β-丙內(nèi)酯滅活，使病毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。優(yōu)點(diǎn)：融合率較高，對(duì)各種動(dòng)物細(xì)胞都適宜，且仙臺(tái)病毒能在雞胚中大量繁殖，容易培養(yǎng)；缺點(diǎn)：仙臺(tái)病毒不穩(wěn)定，在保存過(guò)程中融合活性會(huì)降低，并且制備過(guò)程比較煩瑣。此外，病毒引進(jìn)細(xì)胞后，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)產(chǎn)生干擾

3、。,病毒誘導(dǎo)融合,在不同種類(lèi)的動(dòng)物細(xì)胞混合液中加入聚乙二醇，就會(huì)發(fā)生細(xì)胞凝集作用；聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合的機(jī)理，目前還不太清楚。聚乙二醇是化學(xué)試劑，使用起來(lái)很方便，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率比較高，但是它有一定毒性，對(duì)有些細(xì)胞(如卵細(xì)胞)不適用。,聚乙二醇PEG誘導(dǎo)融合,20世紀(jì)80年代建立起來(lái)的電融合技術(shù)，是將兩種細(xì)胞的混合液置于低壓交流電場(chǎng)中，使細(xì)胞聚集成串珠狀，然后施加高壓電脈沖，以促使細(xì)胞融合。緊密排列的細(xì)胞，當(dāng)受到電擊時(shí)，細(xì)胞部分區(qū)域就

4、會(huì)被擊穿，產(chǎn)生脂雙層膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)連通，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞融合。電融合技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)，如誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率高，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用，操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)性好。,電融合,電融合儀,1. 器具: 顯微鏡 離心機(jī) 天平 離心管 細(xì)滴管 載片、蓋片2. 試劑: 50%聚乙二醇(PEG)：稱(chēng)取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度試管，在酒精燈火或沸水中加熱溶化。待冷至50℃時(shí)，加入等體積并預(yù)熱至50℃的GKN液混勻。Alsver液：葡萄糖2

5、.05g 檸檬酸鈉0.8g NaCl 0.42g，加重蒸水至100ml。GKN 液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4.2H2O 1.77g，NaH2PO4.2H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚紅0.01g，溶于1000ml重蒸水中。0.85%NaCl液,二、實(shí)驗(yàn)器材與試劑,,1.用注射器取2ml Alsver液，再?gòu)囊硐蚂o脈取鴨血2ml，注入管內(nèi)，再加6ml Alsver液，混勻后置4℃冰箱中可備作3-4用。2

6、. 實(shí)驗(yàn)時(shí)取“1”液1ml于離心管中，加入4ml 0.85%的NaCl液，混勻平衡后以1200rpm離心5min。3. 去上清液。再重復(fù)“2”兩次，最后一次離心10min。4. 在沉降血球中加入1mlGKN液，混勻使之成為細(xì)胞懸液。5. 在“4”液中加入6—8滴（約0.5ml）50%的PEG液，迅速混勻，常溫下2-3min滴片鏡檢。,三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法,四、結(jié)果觀察 在高倍鏡下可以看到有兩個(gè)或兩個(gè)以上的鴨血細(xì)胞膜融

7、合在一起，形成一個(gè)異核體細(xì)胞。要注意辨別融合細(xì)胞與重疊的鴨血細(xì)胞。五、融合率的計(jì)算 在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞(包括融合的與未融合的細(xì)胞)，以融合細(xì)胞(含兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞核的細(xì)胞)的細(xì)胞核數(shù)除以總細(xì)胞核數(shù)(包括融合與未融合的細(xì)胞核)即得出融合率。,作業(yè)：描述顯微鏡下細(xì)胞融合的變化，計(jì)算融合率。,細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的結(jié)構(gòu)，它可選擇性地讓某些物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。而對(duì)于不同性質(zhì)的物質(zhì)，細(xì)胞膜的通透性有所不同。當(dāng)

8、細(xì)胞與所處的環(huán)境存在滲透壓差別時(shí)，水分子可從滲透壓低的一側(cè)向高的一側(cè)擴(kuò)散，以至于在高滲環(huán)境中，細(xì)胞會(huì)失水而皺縮；而在低滲環(huán)境中，細(xì)胞會(huì)吸水膨脹直至破裂。,一、實(shí)驗(yàn)原理,紅細(xì)胞膜滲透性觀察,兔紅細(xì)胞滲透壓的觀察1.取一小燒杯，用肝素液（1mg/ml生理鹽水）濕潤(rùn)， 然后加入兔血，以10倍生理鹽水稀釋?zhuān)瞥赏醚?xì) 胞懸浮液.2.取5支試管，編碼后依次向各試管加入1.5%NaCl液 5,3,2,1,0 ml,然后分